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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
- Tissue Staining
- Em uma caixa de coloração à prova de luz, crie uma "câmara de umidade" com tecidos sem fiapos embebidos em água deionizada.
- Seque as bordas da lâmina com um lenço de papel sem fiapos, use uma mini caneta de papanicolau para fazer uma borda repelente de líquidos na borda da lâmina, longe das seções de tecido. Essa borda deve garantir amplo espaço entre o menisco do líquido e a borda do tecido para que a tensão superficial não afete a coloração.
NOTA: A borda repelente de caneta de papanicolau pode ser aplicada antes de 1.1.3 se os anticorpos de interesse não exigirem a recuperação do antígeno de micro-ondas. Se a caneta de Papanicolau tiver sido aplicada antes da lavagem em PBS, a integridade da borda repelente de líquidos deve ser verificada nesta etapa. Use uma caneta mini-pap para preencher as lacunas na borda. - Com as lâminas colocadas horizontalmente, bloqueie a ligação inespecífica do antígeno incubando em soro a 4% v/v em PBS (solução em bloco). Pipetar 300 μl de solução em bloco por lâmina durante 1 hora à temperatura ambiente. Certifique-se de que a solução em bloco se estenda até a caneta de Papanicolau na borda da lâmina e cubra completamente o tecido para evitar manchas irregulares causadas pela tensão superficial perto do tecido.
- Use soro da mesma espécie em que o anticorpo secundário é produzido. Nota: Neste procedimento, os anticorpos secundários são produzidos no burro e, portanto, o soro de burro é usado. Se forem utilizados anticorpos secundários de duas ou mais espécies diferentes, incluir soro de cada espécie.
- Pipete o anticorpo primário nas lâminas. Nota: As concentrações de anticorpos para esta coloração foram otimizadas em 1:5.000 e 1:500 para Iba1 e Pan-neuronal, respectivamente. Descobriu-se que essas concentrações mostram coloração significativa sem coloração de fundo.
- Dilua a solução em bloco para soro a 1% em PBS e adicione anticorpos primários. Pipete 300 μl de solução de anticorpo primário em soro a 1% por lâmina. Novamente, certifique-se de que o fluido esteja na borda da caneta de papanicolau. Incubar durante a noite a 4 °C.
- Inclua três lâminas de controle: uma que não contém anticorpos Iba1 nem Pan-neuronal, uma com Iba1 sem anticorpo Pan-neuronal e uma com anticorpo Pan-neuronal sem Iba1. Pinte essas lâminas na mesma corrida com as mesmas soluções, mas omita os anticorpos primários para testar a ligação não específica dos anticorpos secundários.
- Na manhã seguinte, lave as lâminas três vezes em PBS por 5 min cada, trocando a solução entre as lavagens.
- Os anticorpos fluorescentes são sensíveis à luz, portanto, a partir deste passo adiante, minimize a exposição à luz, garantindo que os recipientes de lavagem sejam embrulhados em papel alumínio e que as caixas de hibridização sejam pretas ou incubadas no escuro. Pipetar os anticorpos secundários adequados em todas as lâminas e incubar durante 60 minutos à temperatura ambiente a uma concentração de 1:250 em solução em bloco (ver passo 1.2.3) numa "câmara de humidade" estanque à luz (ver passo 1.2.1).
- Use anticorpos secundários de diferentes comprimentos de onda. Aqui, para o anticorpo primário coelho anti-Iba1, use o anti-coelho de burro 594 como o anticorpo secundário apropriado. Para o anticorpo primário anti-pan-neuronal de camundongo, use anti-camundongo de burro 488 como o anticorpo secundário apropriado. Como alternativa, use anti-coelho 488 e anti-mouse 594.
- Lave as lâminas três vezes em PBS por 5 min cada.
- Opcional: execute a coloração nuclear.
- Coloque em Hoechst (ou outra coloração nuclear) a uma concentração de 0,03 μg/ml em H2O por exatamente 60 seg.
- Lave as lâminas três vezes em PBS por 5 min cada.
- Wash in ddH2O.
- Coverslipping
- Coverslip slides com um meio de montagem aquoso, como Fluoromount-G ou ProlongGold. Tome cuidado para remover todas as bolhas usando um aplicador com ponta de algodão.
Nota: Outros agentes de montagem podem ser usados, no entanto, um alto sangramento entre os corantes foi observado por alguns dias após a aplicação da lamínula. - Use esmalte transparente para selar as bordas, evitando que as seções sequem devido à evaporação. Deixe o verniz secar num recipiente estanque, mantendo-se as lâminas planas e à temperatura ambiente, e conserve-o num recipiente estanque e envolto em papel alumínio a 4 °C.