Coloração imuno-histoquímica de biomarcadores em seções de neuroesferas de tumores cerebrais

Resumo

Fonte: Núñez, F. J., et al. Avaliação de biomarcadores em glioma por imuno-histoquímica em culturas de neuroesferas de glioma 3D embebidas em parafina. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra uma técnica imuno-histoquímica para rotular biomarcadores tumorais em neuroesferas tumorais cerebrais embebidas em parafina. As seções da neuroesfera são submetidas à remoção e reidratação da parafina, seguida de tratamento para expor os locais dos biomarcadores. Anticorpos primários e secundários são então aplicados para rotular esses biomarcadores. Os anticorpos secundários são ligados por enzimas peroxidase conjugadas com avidina, que oxidam substratos cromogênicos para indicar a localização dos biomarcadores. Finalmente, a contracoloração nuclear e a preparação da lâmina são concluídas para análise microscópica.

Protocolo

1. Imuno-histoquímica (IHQ) de neuroesferas (NS) embebidas em parafina

1. Derreta a parafina colocando as lâminas em uma prateleira de metal e incubando-as a 60 °C por 20 min.
2. Desative as lâminas por incubação em um trem de reidratação à temperatura ambiente (RT): 3x xileno por 5 min, 100% 2x etanol por 2 min, 95% 2x etanol por 2 min, 70% 1x etanol por 2 min e 1x água deionizada por 2 min. Em seguida, mantenha as lâminas em água da torneira até a recuperação do antígeno, pois o ressecamento causará a ligação de anticorpos não específicos.
3. Incubar as lâminas em tampão citrato (ácido cítrico 10 mM, detergente não iónico a 0,05%, pH 6) a 125 °C durante 30 s e a 90 °C durante 10 s. Deixe esfriar e depois enxágue as lâminas 5 vezes com água destilada.
4. Incube as lâminas em RT em 0,3% H₂O₂ por 30 min.
5. Lave as lâminas 3 vezes em tampão de lavagem (0,025% de detergente em solução salina tamponada com Tris [TBS]) por 5 min com agitação suave.
6. Incubar as lâminas em RT com solução de bloqueio (soro de cavalo a 10%, albumina de soro bovino a 0,1% [BSA] em TBS) durante 30 min.
7. Incubar as lâminas durante a noite a 4 °C numa câmara humidificada com anticorpo primário preparado em solução de diluição (BSA a 0,1% em TBS). Lave as lâminas 3 vezes em tampão de lavagem por 5 min com agitação suave.
8. Incubar as lâminas à RT durante 1 h com um anticorpo secundário biotinilado preparado em solução de diluição. Lave as lâminas 3 vezes em tampão de lavagem por 5 min com agitação suave.
9. Incubar as lâminas em RT no escuro durante 30 min com complexo peroxidase de rábano biotinilado avidina. Lave as lâminas 3 vezes em tampão de lavagem por 5 min com agitação suave.
10. Incube as lâminas com 3,3′-Diaminobenzidina (DAB)-H₂O₂ }marcas de substrato aqui por 2-5 min em RT.
11. Enxágue 3 vezes com água da torneira. Mergulhe (1-2 s) as lâminas em solução de hematoxilina para contracorá-las e, em seguida, enxágue-as abundantemente em água da torneira até ficarem limpas.
12. Desidrate as lâminas da seguinte forma: incubar em água destilada por 2 min, mergulhar 3 vezes em etanol a 80%, incubar em etanol a 95% 2 vezes por 2 min cada, incubar em etanol a 100% 2 vezes por 2 min cada e, finalmente, em xileno 3 vezes por 3 min cada.
13. Aplique lamínula nas lâminas com um meio de montagem à base de xileno e deixe-as secar em uma superfície plana em RT até que estejam prontas para a geração de imagens.

NOTA: Se estiver realizando coloração DAB, as lâminas podem ser armazenadas em RT. No entanto, se for realizada coloração por imunofluorescência, as lâminas devem ser armazenadas no escuro a -20 °C para reduzir o fotobranqueamento.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cruz Biotechnology	sc-15408	IHC, diluição
Rabbit polyclonal anti-Ki-67	Abcam	Ab15580	IHC, diluição 1:1000
Rabbit polyclonal anti-OLIG2 Millipore AB9610 IHC, diluição 1:500	Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated Dako E0432 IHC, diluição 1:1000	Vectastain Elite ABC HRP kit Vector Laboratories Inc PK-6100
Biocare	medical BDB2004 L/preço até 12/18

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