Análise ultraestrutural de uma seção cerebral de camundongo usando microscopia eletrônica de transmissão

Abstract

Fonte: Lutz, D., et.al. Avaliação dos parâmetros de neuroplasticidade ultraestrutural após transdução in utero do cérebro e da medula espinhal de camundongos em desenvolvimento. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra a preparação e análise de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de uma seção do cérebro de um filhote de camundongo. O protocolo começa com tecido fixado em tetróxido de ósmio embebido em resina, seguido de corte preciso para isolar a região de interesse e ultramicrotomia para produzir cortes semifinos e ultrafinos, que são visualizados usando microscopia de luz e TEM, respectivamente.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Seleção de Parâmetros de Neuroplasticidade Ultraestrutural para Análise Quantitativa

1. Mapeando a área de interesse
   1. Escolha uma área de interesse (por exemplo, hipocampo ou cerebelo) e localize a área no atlas de seção escolhendo a imagem do atlas que contém essa área.
   2. Esboce as bordas da área de interesse na imagem da seção e encontre/sobreponha essas bordas da região na amostra de resina.
   3. Marque as bordas da área de interesse (por exemplo, hipocampo ou cerebelo) na amostra de resina, usando um calibre de agulha fina (26 G, 1 pol).
   4. Aqueça a amostra de resina a 85 °C em um forno para amolecer a resina para aparar ou, alternativamente, use um dispositivo de corte, uma lâmina fina ou lixa.
   5. Extirpar a área de interesse da amostra de resina com uma lâmina de barbear. Montar o provete em barras de suporte de vidro acrílico do calibre necessário (por exemplo, com um diâmetro de 8 mm e um comprimento de 1 cm) com cola. Apare a amostra montada para seccionamento semifino e ultrafino.
   6. Prepare seções semifinas (0,75 μm) e ultrafinas (70 nm) da área aparada usando um ultramicrótomo: ajuste-o em 1,5 mm/s para 0,75 μm de espessura e em 0,7 mm/s para 70 nm de espessura.
   7. Colete as seções semifinas em suportes de vidro e pinte as seções com azul de toluidina a 1% em PBS (por 4 min).
   8. Lave as seções várias vezes em água deionizada. Examine as seções coradas ao microscópio óptico usando objetivas 4x (NA de 0,1 ∞/-), 10x (NA de 0,22 ∞/0,17), 40x (NA de 0,65 ∞/0,17) e 100x (NA de 1,25 ∞/0,17).
   9. Colete seções ultrafinas em grades de níquel. Submeter as grades a TEM a 180 kV e a uma ampliação de 3.200x, 6.000x e/ou 8.000x.
2. Análise TEM
   1. Escolha os parâmetros ultraestruturais de interesse para análise quantitativa de TEM (por exemplo, botões com vesículas e mitocôndrias ou axônios mielinizados e não mielinizados) e tire imagens TEM desses parâmetros com ampliação de 3.500x, 6.000x e/ou 8.000x.

Materials