Imagem Microscópica Eletrônica de Transmissão da Endocitose da Vesícula Sináptica em Neurônios do Hipocampo de Camundongos

Resumo

Fonte: Villarreal, S., et. al., Medindo a endocitose da vesícula sináptica em neurônios do hipocampo cultivados. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra a análise da endocitose de vesículas sinápticas em neurônios do hipocampo cultivados por meio de marcação de peroxidase de rábano e microscopia eletrônica.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

Microscopia eletrônica

1. Prepare uma solução de estimulação com alto teor de K⁺ com HRP (peroxidase de rábano) como 31,5 mM de NaCl, 2 mM de CaCl₂, 90 mM de KCl, 25 mM de HEPES (pH 7,4), 30 mM de glicose, 2 mM de MgCl₂, 0,01 mM CNQX, 0,05 mM AP5 e 5 mg/mL HRP e, em seguida, ajuste para pH 7,4 com 5 M NaOH.
   1. Estimule a cultura de neurônios do hipocampo com 1,5 mL de solução de estimulação de K ⁺ à temperatura ambiente (referida como K ⁺ ) pela adição de 1,5 mL a cada poço por 90 s. Na condição de repouso (referida como R), aplique a mesma concentração de 5 mg/mL HRP por 90 s, mas com solução salina normal. Para a amostra de recuperação, aplique uma solução de estimulação com alto teor de K⁺ como com a amostra de K⁺, depois lave rapidamente e substitua por solução salina normal e incube por 10 min.
2. Fixação e coloração
   
   1. Prepare o tampão cacodilato de 0,1 M Na usando 21,4 g/L de cacodilato de Na em pH 7,4. Fixe as células com glutaraldeído a 4% em tampão cacodilato 0,1 M Na por pelo menos 1 h à temperatura ambiente. Lave três vezes com tampão cacodilato 0,1 M Na por 7 min cada.
   2. Prepare a solução de diaminobenzidina (DAB), composta por 0,5 mg / mL de DAB com 0,3% de H ₂ O ₂ em ddH ₂ O e filtre com um filtro de 0,22 μm. Aplicar 1,5 ml de solução DAB durante 30 min a 37 °C. Lavar três vezes com tampão cacodilato 0,1 M Na durante 7 min cada.
      CUIDADO: DAB é um agente cancerígeno tóxico e suspeito. Por favor, use luvas e jalecos.
      NOTA: A marcação com DAB ocorre devido à sua oxidação por H₂O₂, conforme catalisado por HRP. Pequenos aumentos nos componentes resultam em um aumento do sinal na amostra. Aumentar a concentração de HRP acelera o efeito do catalisador. Concentrações suficientemente grandes de H₂O₂ permitem reações colaterais debilitantes com HRP, inibindo o efeito da rotulagem³². Neste trabalho, as concentrações desse sistema de marcação foram escolhidas com base nas pesquisas atualmente disponíveis.
   3. Incubar os neurônios com 1,5 mL de OsO a 1% ₄ em tampão cacodilato de 0,1 M Na por 1 h a 4 ° C como pós-fixação. Lave três vezes com 1,5 mL de tampão cacodilato 0,1 M Na por 7 min cada.
      CUIDADO: Devido à toxicidade e reatividade do OsO₄, manter a amostra no gelo em uma capa química é preferível, em muitos casos, a usar uma geladeira para a incubação.
   4. Prepare tampão acetato de sódio 0,1 M com 13,61 g/L de acetato de sódio e 11,43 mL/L de ácido acético glacial a pH 5,0. Lave três vezes com 1,5 mL de tampão de acetato 0,1 M a pH 5,0 por 7 min cada e incube com 1,5 mL de acetato de uranila a 1% em tampão acetato 0,1 M a pH 5,0 por 1 h a 4 ° C. Lave três vezes com 1,5 mL de tampão acetato 0,1 M por 7 min cada.
      
3. Incorporação de epóxi
   
   1. Desidratar a cultura de neurônios com lavagens únicas de 1,5 mL de etanol a 50%, 70% e 90%, por 7 min em cada e depois 3 lavagens de 1,5 mL de etanol a 100% por 7 min cada em uma capela de exaustão.
   2. Misture 485 mL/L de resina epóxi bisfenol-A-(epicloridrina), 160 mL/L de anidrido dodecenil succínico (DDSA), 340 mL/L de anidrido metil-5-norborneno-2,3-dicarboxílico (NMA) e 15 mL/L de 2,4,6-tris(dimetilaminometil)fenol (DMP-30) para criar a resina epóxi. Misture bem e guarde sob vácuo para remover as bolhas de ar.
      NOTA: É fundamental remover as bolhas de ar na resina, especialmente aquelas menores do que visíveis a olho nu, pois elas podem causar cáries na resina durante o seccionamento.
   3. Infiltre a amostra substituindo o etanol por resina epóxi a 50% em etanol por 30 min em temperatura ambiente em um agitador e, em seguida, resina epóxi a 70% em etanol por 30 min em temperatura ambiente em um agitador.
   4. Troque a solução de resina epóxi por resina epóxi 100% e incube por 10 min a 50 °C. Realize duas trocas de resina epóxi 100% fresca com incubações por 1 h a 50 °C. Adicione resina epóxi 100% fresca e deixe endurecer a 50 °C durante a noite e depois a 60 °C por mais de 36 h para endurecer.
4. Remova cada amostra da placa de poços com um serrote de joalheiro. Selecione regiões de interesse, concentrações densas de células, usando um microscópio de luz invertida e, em seguida, corte blocos de 70 a 80 nm para seccionamento por micrótomo. Monte a região cortada no mandril do micrótomo e carregue o micrótomo. Posicione o mandril no micrótomo e monte uma faca de diamante com a borda paralela à superfície do bloco. Colete seções de 70 a 80 nm de espessura diretamente em grades individuais.
5. Dissolva o acetato de uranilo em água para obter uma solução a 1% em peso e dissolva separadamente o citrato de chumbo em água para obter uma solução a 3% em peso. Contra-core as seções por submersão com acetato de uranila aquoso a 1% por 15 min e, em seguida, citrato de chumbo aquoso a 3% por 5 min para melhorar o contraste das amostras.
6. Imagem EM
   1. Examine as seções com um microscópio eletrônico de transmissão e registre imagens com uma câmera digital CCD com uma ampliação primária de 10.000-20.000X.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Neurobasal medium	Thermo Fisher	21103-049	Meio de crescimento para neurônios, aqueça até 37°C antes de usar
B27	Thermo Fisher	17504-044	Gradiente para diferenciação neuronal
Glutamax	Thermo Fisher	35050-061	Gradient for neuronal culture
Trypsin XI from bovine pancrease	Sigma	T1005	Neuronal culture-digest hippocampal tissues
Deoxyribonuclease I do pâncreas bovino	Sigma	D5025	Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension
Poly-l-lysine	Sigma	P4832	Microscopia eletrônica, substrato para crescimento neuronal, aplicar em placa multipoços por 1 h em temperatura ambiente e depois lavar com água esterilizada 3 vezes
Horseradish peroxidase(HRP)<	P6782	Microscopia eletrônica, marcação de vesículas sinápticas endocitadas catalisando DAB na presença de peróxido de hidrogênio, concentração final é de 5 mg/mL em solução salina normal, fazer fresco antes de usar
Cacodylate de sódio	Electron Microscopy Sciences	12300	Microscopia eletrônica, tampão para fixadores e lavagem, concentração final é de 0,1 N
3,3′-Diaminobenzidina (DAB)	Sigma	D8001	Microscopia eletrônica, marcação de vesículas sinápticas endocitadas, substrato para HRP, concentração final é de 0,5 mg/mL em DDW e filtrado, fazer fresco antes de usar
Hydrogen solução de peróxido	Sigma	H1009	Microscopia eletrônica, marcação de vesículas sinápticas endocitadas induzindo a reação HRP-DAB, concentração final é de 0,3% em DDW, faça fresco antes de usar
Glutaraldehyde<	16365	Microscopia eletrônica, fixadores, concentração final é de 4% em tampão Na-cacodylate, faça fresco antes de usar, agite bem antes de usar
TEM	JEOL	200CX	Microscopia eletrônica, imagem de vesículas endocitadas e alterações
CCD digital camera	AMT	XR-100	Microscopia eletrônica, capturando imagens
Citrato de chumbo	Leica microsystems	16707235	Microscopia eletrônica, coloração de grade

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