Imagem de bioluminescência da neuroinflamação em um camundongo transgênico

Resumo

Fonte: Breid, S., et. al. Imagem de bioluminescência da neuroinflamação em camundongos transgênicos após inoculação periférica de fibrilas de alfa-sinucleína. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra a imagem de bioluminescência da neuroinflamação em camundongos transgênicos, mostrando reações de luciferase-luciferina em astrócitos ativados. O protocolo permite a quantificação não invasiva da ativação astrocítica, auxiliando estudos sobre inflamação do SNC e eficácia terapêutica.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

Animal Model

1. Intercross camundongos Tg(Gfap-luc+/-) hemizigotos com camundongos hemizigotos Tg(M83+/-) para gerar camundongos Tg(M83+/-) bigênicos hemizigotos.
2. Genótipe a progênie com PCR em tempo real para a presença do transgene que codifica alfa-sinucleína humana e com PCR padrão para luciferase de vaga-lume.
3. Inocular os animais com a idade de seis a oito semanas.

Inoculum Preparation

1. Prepare alfa-sinucleína humana recombinante monomérica com a mutação A53T em tampão salino tampão Tampolado com Tris (TBS) contendo 150 mM de NaCl em 20 mM de Tris-HCl (pH 7,2).
2. Prepare a alfa-sinucleína fibrilar para inoculações agitando 3 μg/μL de alfa-sinucleína humana recombinante monomérica em um agitador orbital a 800 rpm e 37 °C por 5 dias.
3. Dilua os conjuntos de fibrilas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para atingir uma concentração final de 1 μg/μL para inoculações intraperitoneais.
4. Fragmente as fibrilas de alfa-sinucleína com um sonicador de bastonete por 1 min (40 pulsos de duração de 0,5 s com uma pausa de um segundo entre cada pulso e amplitude definida para 50%) no gelo. Para evitar contaminação por semeadura cruzada. Use sondas de sonicação limpas para preparar diferentes inóculos.

Intraperitoneal Injections

1. Para injeções intraperitoneais, narcotizar os animais brevemente em uma câmara de anestesia por inalação com isoflurano/oxigênio usando uma taxa de fluxo de 2 L/min e o vaporizador ajustado para 2%. Aperte o dedo do pé do animal e confirme se ele não retira o membro posterior para garantir a anestesia adequada.
2. Encha uma seringa hipodérmica descartável de 27 G com 50 μL de fibrilas de alfa-sinucleína sonicadas ou PBS.
3. Injete diretamente no peritônio do camundongo e evite penetrar no intestino delgado ou ceco localizado atrás da parede abdominal, segurando o animal em posição dorsal com a cabeça voltada para longe do investigador e para baixo a aproximadamente 45°. Monitore os animais até que eles se recuperem da anestesia.

Bioluminescence Imaging

1. Image Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) camundongos a cada 2-4 semanas usando um sistema de imagem de bioluminescência.
2. Antes da imagem, anestesiar brevemente os camundongos em uma câmara de isoflurano/oxigênio com uma taxa de fluxo de 2 L/min e o vaporizador ajustado para 2%. Aperte o dedo do pé do animal e confirme se ele não retira o membro posterior para garantir a anestesia adequada.
3. Raspe e depile as cabeças dos ratos com um creme depilatório. Pinte as orelhas de preto com um marcador não irritante para bloquear a bioluminescência inespecífica.
4. Diluir o sal de D-luciferina potássica, o substrato da luciferase, em PBS para uma solução-mãe de 30 mg/ml. Armazene em alíquotas de 1 mL a -20 °C. Proteja a D-luciferina dissolvida da exposição à luz.
5. Pesar os animais antes da injeção. Calcular o volume exato de D-luciferina injetável de 150 mg/kg de peso corporal. Injete D-luciferina por via intraperitoneal e retorne o animal à câmara de anestesia.
6. Inicie o software de imagem. Depois que o sistema de imagem atingir sua temperatura operacional, inicialize o sistema clicando no botão 'Inicializar' no painel de controle.
7. Selecione os botões 'Luminescente' e 'Fotografia'. Defina o tempo de exposição para 60 seg., o binning para 'Medium', o F/Stop para '1' e o ganho EM para 'Off'.
8. Confirme se o filtro de excitação está definido como 'Block' e o filtro de emissão como 'Open' e defina a altura do assunto para 1.50 cm.
9. Dez min após a injeção com D-luciferina, coloque os animais na placa de aquecimento na câmara de imagem e certifique-se de que seus focinhos estejam corretamente colocados na saída de anestesia. Feche o fluxo de isoflurano/oxigênio da câmara de inalação e abra o fluxo para a câmara de imagem com uma taxa de fluxo de 0,25 L/min e uma evaporação de 2%. Feche a porta da câmara de imagem corretamente.
10. Clique no botão 'Adquirir' para medir a bioluminescência, que leva 60 s.

Materiais

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Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
27-gauge syringe<	613-4900
Isoflurano	Piramal Healthcare	PZN 4831850
Depilatory cream	Veet
Secureline lab marker	Neolab	25040
D-luciferina potassium salt	Acris	LK10000	30 mg/mL stock
Thermomixer	Eppendorf	5776671
Sonopuls Mini20 sonicator	Bandelin	3648
IVIS Lumina II imaging system	PerkinElmer
Living Image 3.0 Software	PerkinElmer
Tg(M83+/-) mouses ou B6; Camundongos C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J	The Jackson Laboratory	4479