Marcação retrógrada de neurônios motores de Drosophila usando corantes lipofílicos fluorescentes

Resumo

Fonte: Inal, M. A. et. al., Rastreamento retrógrado de Drosophila neurônios motores embrionários usando corantes fluorescentes lipofílicos. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra o método de rotulagem retrógrada de Drosophila neurônios motores usando corantes lipofílicos. O corante entra no axônio, viaja retrógrada e rotula os neurônios em verde, permitindo a visualização detalhada de sua morfologia e projeções sob um microscópio confocal.

Protocolo

1. Equipamentos e suprimentos

1. Materiais para coletar embriões e treinar adultos para botar ovos
   1. Preparar o aparelho de filtração cortando um tubo de 50 ml e abrindo um orifício na tampa para definir um filtro de malha com poros de 100 μm (Tabela de Materiais) entre o tubo e a tampa.
      NOTA: Alternativamente, filtros de células com poros de 100 μm (Tabela de Materiais) podem ser usados para a etapa de filtração da coleta de embriões.
   2. Faça placas de ágar-ágar com pré-mistura de ágar uva (Tabela de Materiais) de acordo com as instruções listadas. Agite delicadamente um pacote da mistura do pó em 500 mL de água destilada à temperatura ambiente (RT, 23 °C) (dH₂O) e leve a mistura dissolvida ao micro-ondas até ferver vigorosamente. Depois de esfriar a 70-75 ° C, despeje a mistura em placas de Petri (60 mm). Depois de solidificar o ágar-ágar, conservar as placas a 4 °C.
   3. Prepare a pasta de fermento misturando fermento seco ativo (Tabela de Materiais) e água até obter uma consistência de pasta e mantenha a 4 °C.
   4. Use gaiolas de coleta de ovos (para placa de Petri de 60 mm, Tabela de Materiais) que forneçam fluxo de ar suficiente.
      
2. Preparação de agulhas de dissecção e micropipetas de injeção de corante
   1. Prepare a micropipeta de injeção de corante e a agulha de dissecção do mesmo tubo capilar com um diâmetro interno de 0,6 mm e um diâmetro externo de 1,2 mm (Tabela de Materiais). Puxe o tubo capilar por um extrator de micropipeta a 7% da saída máxima de 170 V (Tabela de Materiais) para criar uma agulha afiada com um cone de ~0.4 cm de comprimento.
   2. Para injeção de corante, ajuste a micropipeta com uma micropipeta chanfrada (Tabela de Materiais) por uma técnica de chanfro de bolhas descrita no manual do instrumento.
      1. Resumindo, molhe o moedor com um agente umectante (Tabela de Materiais) para evitar que a água 'arraste' a ponta da agulha. Coloque a agulha na micropipeta clamp a 25−30° e abaixe a ponta em dois terços do raio para fora do centro da superfície de chanfro. Triture a agulha enquanto uma seringa com tubo empurra o ar para dentro da agulha para garantir que a micropipeta fique livre de aparas de vidro.
      2. Marque a micropipeta com um marcador permanente de ponta fina para indicar a posição da abertura na ponta após o chanfro, pois é difícil localizar a abertura estreita da micropipeta que é formada em ângulo.

2. Preparação para a coleta

1. de embriõesCertifique-se de que as moscas adultas (20-40 Canton-S do tipo selvagem ou moscas brancas), machos e fêmeas, sejam mantidas em condições jovens (<7 dias) e saudáveis para a coleta ideal de ovos.
   NOTA: Para estimular a postura dos ovos, as moscas são treinadas em sua gaiola de coleta de ovos alguns dias antes da coleta de ovos em placas de ágar listradas com pasta de fermento pelo menos uma vez por dia.

3. Embryo Staging

1. Permita que as moscas ponham ovos durante a noite (ou pelo menos 15 h) em RT para coletar os embriões 15 h após a postura dos ovos (AEL), ou seja, estágio 16, para visualizar a dendritogênese da célula do canto anterior (aCC) e dos neurônios motores do camarão cru 3 (RP3). De manhã, recolha o prato com os ovos.
   NOTA: Os embriões em 15 h AEL terão um intestino distinto de 4 câmaras. Para a imagem, diferentes estágios seguem seus critérios morfológicos específicos e condições de envelhecimento.
2. Para coletar os embriões, descorione os ovos colocados no prato com 50% de água sanitária por 5 min.
3. Uma vez que os córions tenham clareado, despeje o conteúdo da placa através do aparelho de filtração ou filtro de células para isolar os embriões. Usando uma garrafa de água, dilua o alvejante deixado no prato e reúna o maior número possível de embriões decantando a mistura no filtro.
4. Lave os embriões no filtro 3−4x com mais água ou até que o odor de alvejante se dissipe. Remova o filtro do aparelho e lave os embriões em outra placa limpa com água. Transvase a água da nova placa em que os embriões estão.
5. Prepare uma lâmina de vidro cobrindo-a com duas camadas de fita de vinil no centro, formando um retângulo. Corte uma piscina retangular da fita usando uma lâmina de barbear. Coloque uma tira fina de fita dupla-face em direção à extremidade superior da piscina, é aqui que os embriões serão colocados conforme mostrado na Figura 1.
6. Usando uma pinça fina, selecione individualmente 5−10 embriões a 15 h AEL e coloque-os na fita dupla face com o lado dorsal voltado para cima. Adicione solução salina de Ringer de inseto à piscina de dissecação para proteger os embriões da dessecação (Figura 1).

4. Dissecção e coloração

1. Usando uma agulha de vidro sob um microscópio de dissecação (Tabela de Materiais), corte a linha média de um único embrião em sua superfície, da extremidade posterior à anterior. Em seguida, arraste o embrião para fora da membrana vitelina da fita para o vidro (encaixotado na Figura 1). Tome cuidado para não danificar os tecidos internos do embrião.
2. Inverta os tecidos epiteliais do centro e prenda a borda epidérmica na superfície da lâmina de vidro (Figura 1, inserção).
3. Usando uma agulha conectada por tubo com uma abertura de ponta de ~300 μm (preparada quebrando a ponta fina de uma agulha de dissecação), aspire ou sopre ar para destacar e remover os troncos traqueais longitudinais dorsais, bem como quaisquer vísceras restantes.
4. Use paraformaldeído (PFA) a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para fixar os embriões por 5 min em RT. Lave os embriões 3x com PBS.
5. Manchar os embriões com 1 μL de anticorpo anti-peroxidase de rábano conjugado com corante cianina 3 (anti-HRP Cy3) (Tabela de Materiais) em 200 μL de PBS por 1 h. Lave os embriões com PBS 3x após a coloração.
   NOTA: O corante anti-HRP pode ser alterado com base nos corantes lipofílicos de escolha para injeção.

5. Enchimento da micropipeta de injeção

1. Heat corantes lipofílicos (5 mg/mL de 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine, perclorato (DiO) ou 1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindodicarbocianina, sal de 4-clorobenzenossulfonato (DiD), Tabela de Materiais) a 60 °C numa mistura de etanol e óleo vegetal a 1:10 antes da utilização.
2. Prepare uma lâmina de corante dissolvido em óleo para a micropipeta de injeção. Coloque a micropipeta no suporte capilar (Figura 2, #1). Usando o micromanipulador (Tabela de Materiais), ajuste a micropipeta para ficar sobre a lâmina de tinta. Em seguida, ajuste o estágio para colocar a micropipeta no corante (Figura 2, # 2).
3. Para encher a micropipeta, use um microinjetor (Tabela de Materiais) (Figura 2, #3). Colete o corante na micropipeta ajustando o P_i (pressão de injeção) entre 200-500 hPa (hectopascal), o T_i (tempo de injeção) entre 0,1-0,5 s e P_c (pressão de compensação) para 0 hPa por 5 min (Figura 2, # 4).
4. Uma vez que o corante tenha sido coletado, remova a lâmina de corante e coloque a amostra no microscópio stage. Em seguida, aumente o Pc para uma faixa de 20 a 60 hPa antes de abaixar a micropipeta na amostra para evitar a contaminação do PBS por ação capilar.

6. Injeção de corante em neurônios

1. Localize o embrião no centro usando o microscópio com lente objetiva de 10x (Tabela de Materiais) e alinhe a micropipeta com o embrião.
   NOTA: O tamanho da gota de corante pode ser ajustado alterando o Pi ou o tamanho da abertura da ponta da micropipeta. A gotícula deve ter 10−20 μm, que é aproximadamente a largura de 1 músculo.
2. Mude a lente objetiva para uma lente 40x de imersão em água (Tabela de Materiais) e mergulhe a lente em PBS para ver o embrião.
   1. Use microscopia de fluorescência para verificar a morfologia neuronal marcada pelo anti-HRP Cy3 e determinar o local da injeção.
   2. Durante a injeção, use microscopia de campo claro para ver a gota de corante. Quando o embrião estiver em foco, mude a posição da micropipeta para fazer contato suave com a ponta do axônio de interesse (por exemplo, aCC, RP3).
   3. Solte o corante em um hemissegmento abdominal direito (A2−A6) na junção neuromuscular de aCC ou RP3 (Figura 3) com DiD ou DiO, usando os neurônios marcados por anti-HRP Cy3. Usando o controle manual (mouse; Figura 2, 5) libere o corante e remova a micropipeta após soltar o corante com o micromanipulador e passe para o próximo local de injeção.
      NOTA: Ao contrário de outros corantes (por exemplo, amarelo de Lúcifer, calceína) que se espalham para as células vizinhas através de junções comunicantes, os corantes lipofílicos se associam às membranas celulares e não são transferidos para os vizinhos. Devido ao tamanho relativamente grande da gota de corante, no entanto, essa técnica também resulta na marcação dos músculos parceiros (Figura 3A).
3. Incube a amostra em RT por 1 h após a gota de corante antes da geração de imagens.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui antes da montagem, e a amostra pode ser mantida a 4 °C durante a noite. Os corantes lipofílicos também podem ser administrados usando iontoforese se um amplificador intracelular de acoplamento direto (DC) estiver prontamente disponível.

7. Aquisição de imagens com um microscópio

1. confocalRemova a fita dupla-face e a fita de vinil da lâmina de vidro com a ajuda de uma pinça.
2. Prepare uma lamínula (22 x 22 mm2 No.1 cover glass) com uma pequena quantidade de graxa a vácuo (Tabela de Materiais) nos quatro cantos e coloque cuidadosamente sobre a amostra, evitando bolhas de ar. Remova qualquer excesso de PBS usando limpadores de tarefas.
3. Empurre a lamínula para baixo para ajustar a distância de trabalho entre a lente objetiva e a amostra. Sele completamente as bordas da lamínula com esmalte.
4. Image com ampliação de 10x e 100x usando um microscópio confocal.

Resultados

Figura 1: Configuração da piscina de dissecação. A câmara azul vista na lâmina de vidro é criada com fita de vinil mantendo os amortecedores dentro. A fita dupla face segura os embriões que estão devidamente alinhados. Também ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10x objective lens	Nikon		Plan
40x water-immersion lens	Nikon		NIR Apo
Capillary tubing	Frederick Haer&Co	27-31-1
Confocal microscope	Andor	N/A	Dragonfly Spinning disk confocal
Cover glass	Corning		22x22 mm Square #1
DiD	ThermoFisher	V22886
DiI	ThermoFisher	V22888
DiO	ThermoFisher	V22887
Dissecting microscope	Nikon	N/A	SMZ-U
Fita dupla face	Scotch	665
Dow corning graxa de alto vácuo	Fisher Sci.	14-635-5D
Dumont #5 Forceps	Ferramentas de Belas Ciências	11252-20
Egg collection cage	FlyStuff	59-100
FemtoJet 5247	Eppendorf	descontinuado	FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)
Micromanipulator	Sutter	MP-225
Chanfrador de micropipeta	Sutter	BV-10-B
Extrator de agulha	Narishige	PC-100
Nutri-fly pacotes de pré-mistura de ágar uva em pó	FlyStuff	47-102
Nylon net filter	Millipore
Paraformaldeído 16% solution, EM grade	Electron Microscopy Sciences	15710	Any EM grades
PBS	Roche	11666789001	Vendido em sigmaaldrich, solução 10x em caixa
Photo-Flo 200	Kodak	146 4510	Agente umectante
Microscópio de fluorescência vertical	Nikon	N/A	Eclipse Ci com uma fonte
Fita isolante de vinil	Scotch	6143
VWR Cell strainers	VWR	10199-659
Yeast	FlyStuff	62-103	Fermento seco ativo (RED STAR)

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