Microscopia de Imunofluorescência de Células Neurais Diferenciadas de Células Derivadas do Sangue Periférico

Resumo

Fonte: Becker-Kojić, Z. A., et. al., Geração Livre de GM de Células Neuronais Derivadas do Sangue. J. Vis. Exp. (2021)

O vídeo demonstra um protocolo para preparar células neurais derivadas de células do sangue periférico reprogramadas para microscopia de fluorescência, mostrando diferentes tipos de células e estágios de desenvolvimento por meio de imagens de imunofluorescência.

Protocolo

1. Análise de microscopia de imunofluorescência de células neurais derivadas do sangue
   1. Cultive as células por 16 dias e remova a mídia.
      1. Incubar com fixador pré-aquecido composto por 75 mL de água estéril, 4 g de paraformaldeído. Adicione 10 N NaOH conforme necessário e mexa até que a solução clareie. Em seguida, adicione 10 mL de PBS 10x, 0,5 mL de MgCl₂, 2 mL de EGTA 0,5 M e 4 g de sacarose. Titular a pH 7,4 com HCl 6 N e levar a 100 mL de água estéril por 15 min.
      2. Descarte o fixador e lave as células 3 vezes por 5 min de cada vez. Adicione imediatamente uma solução Triton X a 0,3% recém-feita e permeabilize as células por 5 min. Lave 3 vezes com PBS e adicione uma solução de bloqueio feita com PBS e 5% de BSA.
      3. Bloqueie as células à temperatura ambiente em uma placa basculante por 1 hora.
      4. Prepare diluições apropriadas de anticorpos em BSA/PBS a 1% e incube as células com diluições de anticorpos em uma placa basculante por 1,5 h à temperatura ambiente. Lave as células 3 vezes com PBS por 5 min cada, incube as células com DAPI e monte as lamínulas com mídia de montagem para visualização em um microscópio.
         NOTA: Os anticorpos marcados diretamente usados neste experimento estão listados na Tabela de Materiais.

Materiais

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Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anti-GFAP Cy3 conjugado	Merck Millipore	MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555	Merck Millipore	MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488	Merck Millipore	MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488	BD Pharmingen	560381
BSA Frac V 7.5%	Gibco	15260037
Multiplatte Nunclon 4 wells	Fisher Scientific	10507591
Neurobasal Medium	Gibco	10888022
PBS estéril	Roth	9143.2
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957-50ML