Analisando estruturas amilóides em uma seção de tecido usando microscopia de imagem de fluorescência

Resumo

Fonte: Nyström, S., et al., Imagem de tecidos amilóides corados com oligotiofenos conjugados luminescentes por microscopia confocal hiperespectral e imagem de tempo de vida de fluorescência. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demonstra a análise de estruturas amilóides com microscopia de imagem de fluorescência ou FLIM, usando corante hFTAA para revelar núcleos compactos como azul/verde e periferias instáveis como vermelho/amarelo em imagens codificadas por cores, refletindo a organização amilóide.

Protocolo

1. Preparação de amostras de tecido

NOTA: Muitos tipos de tecido podem ser fotografados usando ácido heptâmero-formil tiofeno acético (hFTAA) como marcador amilóide. hFTAA é sensível à conformação agregada. A coloração deve, portanto, ser realizada preferencialmente em agregados ininterruptos sem exposição de epítopos. A qualidade espectral ideal é alcançada se a fixação do tecido for mantida no mínimo. Portanto, o material fresco congelado, suavemente fixado em etanol no momento da coloração, é preferido. No entanto, é possível detectar depósitos de amilóide também no tecido que foi fixado com , por exemplo, formalina. A hFTAA geralmente penetra bem no tecido. Selecione uma espessura de amostra compatível com a técnica de imagem pretendida.

1. Se forem usadas seções fixadas em formalina e embebidas em parafina, elas devem ser desparafinizadas em xileno durante a noite. Em seguida, mergulhe as seções em banhos consecutivos de etanol a 99%, etanol a 70%, dH₂O e solução salina tamponada com fosfato (PBS), 10 min em cada. Deixe as seções de tecido secarem em condições ambientais.
   Cuidado: O xileno é sempre manuseado em uma capela de exaustão química. O xileno e outros solventes orgânicos são prejudiciais.
   1. Descongele as criossecções à temperatura ambiente. Fixe as seções de tecido em formalina a 10% durante a noite e reidrate-as mergulhando-as em banhos consecutivos de etanol a 99%, etanol a 70%, dH₂O e PBS, 10 min em cada. Deixe as seções de tecido secarem em condições ambientais.
2. Adicione gotículas da solução de trabalho hFTAA (aproximadamente 200 μL) às seções de tecido para cobri-la. A gota deve permanecer no lugar por tensão superficial. Incube por 30 min em temperatura ambiente para coloração.
3. Enxágue a solução de coloração com 500 μL de PBS usando uma pipeta e, em seguida, mergulhe a lâmina no banho de PBS por 10 min. Deixe a seção secar em condições ambientais.
4. Monte usando o meio de montagem de fluorescência. Deixe o meio de montagem assentar durante a noite.

2. FLIM
NOTA: O microscópio confocal está equipado com uma unidade de microscopia de imagem de fluorescência (FLIM).

1. Configure os seguintes parâmetros para o microscópio confocal: Pinhole, 20; comprimento de onda de excitação, 490 nm; intensidade do laser, 0,5% (correspondendo a uma potência média de 7,5 μW). Use lasers pulsados a 40 MHz.

2. No software FLIM, configure a contagem de fótons acima de 550 nm. Na janela Parâmetros de exibição, siga a contagem de fótons até que a contagem máxima esteja em torno de 4.000 contagens de fótons.

3. Salve o arquivo e exporte-o como uma imagem de contagem de fótons únicos (SPC).

4. Ajuste os dados a um decaimento exponencial de 2 componentes no software FLIM. Um ajuste que dá um χ² < 2 é bom. O valor no eixo y é o número de contagens para o tempo de vida determinado.

5. Selecione um limite para as contagens a serem incluídas, , por exemplo, , 100. Código de cores por T1 e selecione a faixa de tempo de vida. O decaimento depende da estrutura amilóide onde a hFTAA está ligada. Foram observados tempos de vida de fluorescência entre 300 e 1.000 ps. Salve o arquivo.

6. Exporte os dados brutos usando as opções de exportação e salve os dados desejados em uma nova pasta.

Materiais

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Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
hFTAA/Amytracker545	Ebba Biotech
Dako Meio de montagem fluorescene	Agilent technologies	GM304
LeicaDM6000	Leica
Lumen 200	Prior
Spectraview system	ASI spectral imaging
Spectraview software	ASI spectral imaging
LSM780	Zeiss
Zen 2010b v6.0 software	Zeiss
FLIM system	Becker & Hickl
Ar/ML 458/488/514	Zeiss
Tunable Laser In Tune	Zeiss