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1.Live Image Recording
- Preparing Cells for Live Imaging
1. Cultura de células neurais hipotalâmicas WT e CCR5-/- expressando proteína de fluorescência verde marcada com o transportador de glicose 4 (GFP-GLUT4) na lamínula de vidro #1,5 (ou 0,17 mm de espessura) que foi pré-revestida com poli-D-lisina na placa de 6 poços.
2. Remova cuidadosamente as lamínulas com neurônios usando uma pinça e coloque-as nas lâminas de vidro com cuidado.
3. Remova o excesso de meio/líquido com lenços delicados. Dobre os lenços duas vezes e coloque-os cuidadosamente em cima da lamínula. Pressione suavemente os lenços sem mover a lamínula.
CUIDADO: Não pressione a lamínula contra a lâmina de vidro com força. O objetivo desta etapa é garantir que a lamínula não se mova/se desloque durante a aquisição da imagem causada pela força de empuxo.
4. Coloque lamínulas e lâminas no microscópio de deconvolução stage, com a lamínula voltada para baixo e presa corretamente. Esta etapa é para garantir que a posição do slide permaneça constante para que os usuários possam rastrear o mesmo conjunto de células de destino posteriormente.
5. Observe as células neurais hipotalâmicas WT e CCR5-/- com uma lente objetiva de imersão em óleo de 60x/1,42 NA.
6. Trate as amostras de células selecionadas com CCL5 (10 ng/mL) ou insulina (10 U/mL) por um min. Adicione 1,5 μL de insulina diluída na borda da lamínula.
7. Visualize e registre as amostras de células selecionadas imediatamente. Programe o software de gravação de vídeo para gravar por 30 min.
2. Microscopia e análise de deconvolução
NOTA: Esta parte do protocolo requer o uso de um microscópio de deconvolução e software especializado para análise.
1. Ligue o sistema de imagem, permita que a platina do microscópio inicialize corretamente e, em seguida, ligue a fonte de luz LED.
2. Adicione óleo de imersão (índice de refração 1,520 para amostras vivas a 37 °C) em uma lente objetiva de 60x 1,42 NA. Coloque a lâmina de amostra no microscópio com a lamínula voltada para a lente objetiva e prenda a lâmina corretamente.
3. Use iluminação de campo claro ou fluorescência para identificar as células-alvo. Ajuste o foco até que as células-alvo possam ser claramente observadas. Não mova a lente objetiva para fora da área da lamínula para evitar arranhões desnecessários.
4. Identifique o transportador de glicose conjugado com proteína de fluorescência verde 4 (GFP-GLUT4) pelo sinal GFP. Identifique as células-alvo desejadas para aquisição de imagens. A posição da célula-alvo selecionada pode ser memorizada para referência futura (consulte a Figura 1).
5. Configure parâmetros experimentais adequados (incluindo número de pixels, comprimento de onda de excitação, porcentagem de transmissão, tempo de exposição, espessura da pilha, intervalo de tempo e tempo total de imagem) em cada célula-alvo. Para este experimento, o número de pixels da imagem foi definido em 512 x 512 (pode ser definido em 1.024 x 1.024 para maior resolução) para sinais GFP. O tempo de exposição foi definido entre 0,025 a 0,05 s para cada 5 min. Pequenos ajustes laterais x, y e z podem ser controlados pelo software recomendado (consulte a Tabela de Materiais).
6. Defina o parâmetro de exposição para aproximadamente 2.000 a 3.000 contagens para obter a intensidade máxima de pixels. Para minimizar o fotobranqueamento de fluorescência, reduza a porcentagem de transmissão de luz de excitação o máximo possível, mantendo o tempo de exposição inferior a 1 s. Repita essas etapas para cada canal de fluorescência adicional e cada área de interesse individual.
7. Defina o limite superior e inferior da pilha Z em cada célula de destino. Isso pode ser conseguido movendo a platina do microscópio até que a parte superior e inferior da célula-alvo estejam ligeiramente fora de foco. Os usuários podem ajustar a resolução do eixo Z definindo o número de imagens entre o limite superior e inferior (o que pode ser feito definindo a distância entre cada imagem).
8. Pilhas de imagens foram deconvolvidas e posteriormente analisadas com a ajuda do respectivo software – Velocity da PerkinElmer neste caso.
