Análise microscópica de sinapses em fatias de hipocampo de camundongos usando imunofluorescência

Abstract

Fonte: McLeod, F., et al. Avaliação da densidade de sinapses em fatias de cérebro de roedores hipocampais. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demonstra um método para visualizar marcadores sinápticos em fatias cerebrais do hipocampo usando análise de imunofluorescência confocal. As fatias são imunomarcadas com anticorpos primários direcionados a marcadores pré-sinápticos e pós-sinápticos, seguidos por anticorpos secundários conjugados com fluoróforo. Os marcadores marcados são então visualizados usando microscopia confocal para avaliar a arquitetura sináptica por meio de sua colocalização.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Preparação aguda da fatia do hipocampo

< estilo de extensão = 'background-color: transparente; cor: #1a202c;'>Remova o cérebro do camundongo o mais rápido possível, usando uma espátula e uma tesoura afiada para cortar o crânio e coloque-o em líquido cefalorraquidiano artificial gelado, oxigenado (95% O₂, 5% CO₂), com alto teor de sacarose (ACSF, ~ 100 mL).

2. Coloque o cérebro do camundongo em uma placa de Petri e remova o cerebelo e uma pequena seção do córtex frontal com um bisturi antes de hemisseccionar a linha média do cérebro.
3. Coloque os dois hemisférios no lado que acabou de ser cortado e cole cada hemisfério no palco de um vibratome.
4. Corte seções de 200 a 300 μm de espessura de toda a região de interesse. No caso do hipocampo, devem ser obtidas aproximadamente 3 a 4 fatias por hemisfério.
5. Usando uma pipeta de plástico Pasteur, transfira as fatias para uma câmara submersa em ACSF oxigenado (95% O₂, 5% CO₂). Manter a 34 °C durante 30 min.
   NOTA: Nesta fase, as fatias podem ser tratadas com agentes farmacológicos ativos, como as proteínas Dickkopf-1 (Dkk1) recombinantes, adicionando os agentes à câmara da fatia.
6. Usando um pincel, remova as fatias da câmara, coloque-as em uma placa de 24 poços e fixe-as por 20 min a 1 h em paraformaldeído a 4% (PFA)/sacarose a 4% à temperatura ambiente (RT).
   Cuidado: PFA é tóxico, use proteção adequada.
7. Lave as fatias três vezes em solução salina tamponada com fosfato 1X (PBS, 10 min cada).
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui por 1 a 2 dias, desde que as fatias sejam mantidas a 4 °C em 1X PBS.

2. Imunofluorescência para marcadores sinápticos

NOTA: As receitas de todos os buffers usados podem ser encontradas na Tabela 1.

1. Nos poços de fatia, substitua o PBS por tampão de bloqueio/permeabilização (Tabela 1) e incube em RT por 4 - 6 h.
2. Dilua o anticorpo policlonal de cobaia contra o transportador vesicular de glutamato 1 (vGlut1) em uma diluição de 1:2.000 no tampão de bloqueio/permeabilização.
   NOTA: vGlut1 é um marcador para visualização terminal excitatória pré-sináptica. Para identificação de sinapse excitatória pós-sináptica, use um anticorpo policlonal contra densidade pós-sináptica-95 (PSD-95) e dilua 1:500 na mesma solução. Use um volume mínimo de 300 μL em cada poço. Para identificar a localização anatômica do hipocampo, use um anticorpo que também possa identificar a estrutura neuronal, como a proteína 2 associada aos microtúbulos (MAP2) ou a tubulina. Calcule as concentrações corretas de todos os anticorpos primários para os marcadores sinápticos de escolha (pré e pós-sinápticos) e dilua em tampão de bloqueio / permeabilização fresco.
3. Incubar as fatias na solução primária de anticorpos durante a noite (ou durante 1 a 2 dias) a 4 °C. Utilizar uma plataforma vibratória com movimentos vigorosos.
4. Lave as fatias três vezes em PBS (10 min cada).
5. Dilua os anticorpos secundários apropriados 1:500 no buffer de bloqueio. Por exemplo, ao usar o anticorpo vGlut1 para cobaias, aplique um anticorpo secundário que reconheça o componente cobaia (por exemplo, anticobaia de burro) conjugado a um fluoróforo específico. Ao usar o anticorpo PSD-95 para coelhos, aplique um anticorpo secundário que reconheça o componente do coelho (por exemplo, anti-coelho para burros) conjugado a um fluoróforo específico diferente.
6. Incubar as fatias nesta solução durante 2 a 3 h à temperatura de saída. Certificar-se de que as fatias estão protegidas da luz, uma vez que os anticorpos secundários são sensíveis à luz.
7. Lave as fatias três vezes em PBS (10 min cada).
8. Remova cuidadosamente as fatias da placa de 24 poços usando um pincel e coloque-as uniformemente em lâminas de vidro pré-rotuladas. Adicione uma gota de meio de montagem em cima de cada fatia e, em seguida, coloque delicadamente uma lamínula de vidro em cima das fatias. Evite a formação de bolhas de ar. Tome cuidado para usar meio de montagem suficiente (300-400 μL), pois uma quantidade insuficiente pode levar a fatias secas.
9. Deixe secar por um mínimo de 1 a 2 dias em RT e mantenha as lâminas protegidas da luz.
10. Armazene as lâminas a 4 °C a curto prazo, mas para armazenamento a longo prazo, mantenha-as a -20 °C.

3. Aquisição e análise

1. de imagens confocaisImagens usando microscopia confocal de varredura a laser.
   1. Identifique a região do hipocampo a ser fotografada (por exemplo, o cornu ammonis 1 e 3 (CA1, CA3) ou o giro dentado (DG)) por meio de uma objetiva de 10x ou 20x.
   2. Mude para uma objetiva de imersão em óleo de 40x ou 63x para garantir que a anatomia da fatia esteja intacta, identificando neurites contínuos e estrutura organizada. Use um marcador neuronal, como MAP2, como referência (Figura 1A).
   3. Em seguida, mude para uma objetiva de imersão em óleo de 60x (abertura numérica [NA] = ~1,3 - 1,4) e ajuste as configurações de cada canal para obter sinal e contraste ideais. Use uma opção de alto/baixo contraste para definir a intensidade de cada laser para evitar a saturação de pixels.
      NOTA: Essas configurações dependerão do microscópio usado, mas consulte a Tabela de Materiais para as configurações de potência do laser. Para obter melhores resultados, use uma resolução de 1024 x 1024 pixels. As configurações devem permanecer constantes ao longo das diferentes condições do mesmo experimento. Zoom adicional pode ser aplicado, se necessário.
   4. Avalie a profundidade onde a coloração é uniforme e adquira pilhas de imagens de pelo menos 8 planos equidistantes (250 nm). Em seguida, pegue 3 pilhas de imagens representativas adjacentes da mesma área de interesse por fatia.
      NOTA: A profundidade pode variar de uma fatia para outra, mas deve estar sempre a aproximadamente 2 a 5 μm da superfície da fatia.
   5. Repita a aquisição em pelo menos 3 fatias por condição e de 6 a 8 animais por grupo de tratamento.

Tabela 1: Tampões usados para coloração imunofluorescente.

KH₂PO₄

Blocking/permeabilizing Buffer	Concentration	Notas
Donkey serum	10%
Triton-X	0.50%
PBS	1x
10x PBS		pH to 7.4
NaCl	1.37 M
KCl	27 mM
NaH2PO4	100 mM
18 mM		4% PFA/4% Sucrose		pH to 7.4
PBS	1x	Diluir de 10x
PFA	1.33 M
Sucrose	117 mM

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Results

Tabela 1: Tampões usados para coloração imunofluorescente.

Blocking/permeabilizing Buffer

Materials