1. Preparação de fatias organotípicas
NOTA: Esta receita usa dois filhotes de camundongo no dia 7-9 pós-natal (p7-9), produzindo 24 fatias organotípicas divididas em dois pratos de cultura de seis poços. Salvo indicação em contrário, todos os procedimentos devem ser feitos com capuz estéril e luvas de nitrilo ou látex devem ser usadas. Apenas devem ser utilizados ingredientes de grau de cultura celular.
- Frascos de autoclave, ferramentas de dissecação (1 tesoura grande, 1 tesoura pequena, 1 espátula plana grande, 1 espátula pequena arredondada e afiada e 1 fórceps; consulte a lista de materiais para obter detalhes), pipetas de vidro, pontas de pipeta e lenços umedecidos foram usados para a preparação da fatia.
- Como metade das pipetas de vidro deve ser usada com a abertura grande, quebre a extremidade estreita.
- Marque com uma caneta riscadora de diamante (se disponível) ao redor da pipeta logo abaixo do ponto onde o vidro começa a se estreitar. Em seguida, coloque a extremidade pontiaguda da pipeta em uma luva de nitrilo ou similar. Quebre cuidadosamente a ponta dobrando a pipeta enquanto a empurra contra uma bancada de trabalho.
- Em seguida, embote a ponta quebrada esfregando-a em um pedaço de lixa ou derreta-a levemente em um bico de Bunsen. As pipetas quebradas são usadas para transferir fatias de cérebro cortadas, com a extremidade quebrada transformada em bulbo de borracha e a grande extremidade aberta tocando a solução / fatias.
NOTA: Isso não é feito em um capuz estéril e pode ser feito com vários dias de antecedência.
- Prepare pratos de cultura.
NOTA: Isso pode ser feito um dia antes de fatiar ou pelo menos 2 horas antes de fatiar. - Esterilize as membranas de politetrafluoretileno (PTFE) ("confete"). Use duas pinças estéreis para remover um único confete dos pedaços de plástico azul ao redor. Em seguida, esterilize mergulhando duas vezes em uma placa de Petri contendo 96% de etanol (EtOH). Em seguida, coloque o confete em uma grande placa de Petri estéril para secar.
NOTA: Os confetes são membranas hidrofílicas de PTFE semelhantes às membranas das inserções de cultura. O uso de confetes auxilia na geração de imagens ao vivo porque fatias únicas podem ser facilmente transferidas do inserto para a configuração do microscópio levantando o confete com uma pinça (consulte 4.8. para obter detalhes). Alternativamente, as fatias de cérebro podem ser cultivadas sem o confete (no qual as fatias se prenderão diretamente à membrana do inserto de cultura). Neste caso, o inserto da membrana deve ser cortado com bisturi para transferir a fatia para o banho de microscópio. - Adicione 1 mL de meio de cultura a cada poço das placas de cultura de seis poços.
- Coloque uma inserção de cultura em cada poço usando uma pinça estéril. Evite bolhas de ar entre o inserto e o meio de cultura.
NOTA: Para economizar dinheiro e o meio ambiente, é possível reutilizar as inserções de cultura. Isso pode ser feito por enxágue completo em água destilada (dH2O) seguido de incubação em EtOH a 70% por um período mínimo de 24 horas até a reutilização. Ao se preparar para uma nova cultura, seque as inserções em uma placa de cultura de células sob luz ultravioleta (UV) por 15-30 min. - Coloque dois confetes (esterilizados e secos) em cada uma das inserções de cultura. Coloque o confete em direção às bordas das inserções para obter uma sobreposição mínima.
- Colocar as placas na incubadora de cultura de células a 37 °C com 5% de CO2.
- Meio de dissecação a frio de bolhas com gás bióxido (95% O2/5%CO2). Para manter a solução estéril, conecte o tubo do cilindro de gás a um filtro de seringa estéril (tamanho de poro de 0,22 μm).
- Acople a outra extremidade do filtro de seringa a um tubo estéril conectado a uma pipeta de vidro estéril. Coloque a pipeta de vidro na solução, cubra-a com parafilme e ligue o gás. Mantenha o meio de dissecção no gelo.
- Prepare a área de dissecação/fatiamento.
NOTA: Idealmente, este procedimento deve ser feito em um capuz estéril. Se isso não for possível, o vibratomo pode ser deixado em uma bancada. Neste caso, recomenda-se o uso de rede capilar e máscara facial. - Usando uma lâmina de barbear de ponta única, corte um pedaço retangular (aproximadamente 2 cm x 0.5 cm) de gel de agarose e cole-o no vibratomo stage de forma que o lado comprido fique voltado para a lâmina do vibratomo.
- Limpe todas as superfícies e as peças do vibratomo com 70% de EtOH e limpe com lenços de papel autoclavados.
NOTA: É importante que todas as peças que entrarão em contato com o tecido cerebral estejam completamente secas, pois o EtOH pode danificar as células. - Conecte uma lâmina de barbear estéril ao vibratomo e faça uma verificação de vibração para ver se o vibratomo tem essa função.
- Coloque ferramentas de dissecção autoclavadas, lenços umedecidos autoclavados, quatro pequenas placas de Petri, um bisturi de borda redonda, duas pipetas de vidro com bulbos de borracha, duas pipetas de vidro abertas (ver pt. 1.1) e super cola (pulverizada com EtOH) no capô.
- Despeje o meio de dissecação borbulhado no barco vibratomo e nas quatro pequenas placas de Petri.
NOTA: Esta etapa só deve ser feita imediatamente antes da dissecação, pois o meio a partir deste ponto não é borbulhado ou mantido no gelo.
- Dissecar e montar cérebros.
NOTA: Para obter fatias saudáveis, esta etapa deve ser feita com rapidez e precisão. É necessária alguma prática. - Eutanasiar o animal # 1 por luxação do pescoço ou de acordo com as diretrizes locais e depois decapitar com a tesoura grande.
- Usando uma tesoura pequena e afiada, remova rapidamente a pele fazendo uma incisão sagital do pescoço ao nariz e puxe-a para o lado para revelar o crânio.
- Corte ao longo da sutura sagital, seguido de incisões laterais sobre a parte interna dos ossos frontais e a sutura lamboidal (a borda entre o cérebro e o cerebelo).
- Use uma pinça para abrir o crânio de cada lado. Os nervos cranianos são cortados do cérebro inserindo uma espátula arredondada e afiada sob o lado ventral do cérebro e movendo suavemente a espátula lateralmente.
- Use uma lâmina de barbear de ponta única para fazer um corte coronal rostral no cerebelo.
NOTA: Este corte determinará o ângulo em que as fatias são cortadas. Deve, portanto, ser feito em ângulo reto. - Vire o cérebro para fora do crânio e coloque-o em uma pequena placa de Petri contendo um meio de dissecação.
- Repita as etapas 1.6.1. - 1.6.4. para o animal # 2 e coloque esse cérebro em uma segunda placa de Petri.
NOTA: Os animais não são estéreis. Realize a dissecção em um lado do capuz e, em seguida, passe para o outro lado, limpo, uma vez que os cérebros tenham sido removidos do crânio. - Troque as luvas.
- Prenda o cérebro ao estágio de vibrato: adicione uma fina camada de super cola ao palco bem na frente do gel de agarose montado. Segure o cérebro # 1 com uma espátula grande e plana com o lado recém-cortado (caudal) tocando a espátula e o lado ventral voltado (e o mais próximo possível) do gel de agarose.
- Em seguida, coloque suavemente o cérebro na cola, empurrando-o para fora da espátula com um conjunto de pinças. Certifique-se de deixar espaço suficiente para o cérebro # 2.
NOTA: É importante que os cérebros estejam bem presos ao palco, mas sem cola excessiva, pois isso pode obstruir o corte.
- Imediatamente após a montagem do cérebro # 1, use a espátula grande para adicionar algumas gotas de meio de dissecção no topo do cérebro. Isso manterá o cérebro úmido, endurecerá a cola e evitará que ela grude nas laterais do cérebro.
- Repita as etapas 1.6.7 e 1.6.8. para o cérebro # 2.
- Prenda o stage no barco vibratomo.
- Corte cortes coronais de 230 μm de espessura com uma amplitude de 1 - 1,5 mm, uma frequência de 85 Hz e uma velocidade de 0,2 mm/s. Colete fatias aproximadamente entre 1,4 mm rostral e 2,1 mm caudal a Bregma.
- Recolher as fatias após cada fatia ter sido cortada, utilizando pipetas de vidro abertas (pt. 1.1). Transfira as fatias para uma placa de Petri contendo um meio de dissecação. Use um bisturi arredondado para cortar as fatias em dois pedaços, dividindo os dois hemisférios.
- Quando todas as fatias estiverem cortadas, coloque as fatias nas placas de cultura.
- Retire o prato de cultura (um de cada vez) da incubadora.
- Usando as pipetas de vidro abertas, transfira cuidadosamente uma fatia para cada um dos confetes.
NOTA: As fatias devem ficar planas no meio do confete. Isso requer alguma habilidade. No entanto, se algumas fatias não forem perfeitas, é melhor deixá-las do que gastar tempo tentando movê-las, pois é importante colocar todas as fatias na incubadora o mais rápido possível. - Use uma pipeta de vidro (extremidade pontiaguda) para remover suavemente o excesso de meio sem tocar na fatia.
NOTA: As fatias não devem ser imersas em líquido durante a incubação. Assim, o excesso de meio deve ser aspirado de forma que as fatias fiquem expostas ao ar (uma fina película de meio ainda cobrirá as fatias). As fatias que permanecem imersas no líquido geralmente não são saudáveis ou morrem (4 e nossas observações). - Mova o prato de volta para a incubadora assim que todos os confetes tiverem uma fatia.
- Repita as etapas 1.7.8. - 1.8.4. para o prato # 2.
- Mude o meio de cultura.
NOTA: Isso deve ser feito no dia seguinte ao corte (dia 1 in vitro, DIV1) e depois a cada 2-3 dias. - Pré-aqueça o meio de cultura em banho-maria ou na incubadora.
- Em uma coifa estéril, use sucção a vácuo ou uma pipeta comum com uma ponta estéril para aspirar o meio de cultura de cada poço. Isso é feito inclinando suavemente o prato (cerca de 30 graus) e colocando a ponta da pipeta na borda do inserto de cultura.
- Remova aproximadamente 800 μL de cada poço (deixando apenas o meio suficiente para manter o fundo da inserção coberto com meio). Em seguida, usando uma pipeta limpa, adicione 800 μL do meio pré-aquecido a cada poço. Em seguida, coloque os pratos de volta na incubadora de cultura de células.
2. Transdução Viral
- Compre ou faça Vírus Adeno-Associados (AAVs) com um plasmídeo de interesse.
NOTA: Este protocolo descreve o uso do sorotipo 2/8 de AAV (AAV 2/8) carregando dsred ou GFP direcionado mitocondrial como um gene repórter sob o controle transcricional do promotor da proteína básica de mielina12 (AAV2/8 MBP_mito_dsred ou AAV2/8 MBP_mito_GFP) para visualizar mitocôndrias de oligodendrócitos. AAV 2/8 carregando GFP ou tdtomato como gene repórter impulsionado pelo promotor CAG geral (AAV 2/8 CAG_GFP ou AAV 2/8 CAG_tdtomato) é usado para visualizar o citoplasma de oligodendrócitos. Assim, a combinação de AAV2/8 MBP_mito_dsred com AAV 2/8 CAG_GFP dá mitocôndrias vermelhas e citoplasma verde em oligodendrócitos, enquanto a combinação de AAV2/8 MBP_mito_GFP e AAV 2/8 CAG_tdtomato dá mitocôndrias verdes e citoplasma vermelho. Os construtos são descritos com mais detalhes em outro lugar13. - No dia 7 in vitro (DIV7), os oligodendrócitos com os AAVs são transduzidos.
CUIDADO: Siga as normas de segurança ao trabalhar com AAVs. Certifique-se de ter o treinamento adequado e a aprovação do Nível de Biossegurança necessária. Todos os pontos a seguir devem ser realizados em um gabinete de biossegurança Classe II usando luvas e jaleco. Aqui, a aplicação de AAV na área do córtex das fatias é descrita, pois esta é a área que apresenta a melhor recuperação. - Diluir o AAV num meio de cultura pré-aquecido (37 °C). Diluições em torno de 2 × 109 cópias do genoma/mL (GC/mL) são recomendadas para obter uma transdução esparsa de oligodendrócitos que permite a obtenção de imagens de células individuais dentro da fatia. No entanto, um piloto usando títulos diferentes deve ser feito para garantir uma densidade de oligodendrócitos transduzidos que seja adequada para os experimentos específicos. Se forem utilizados dois AAVs diferentes, estes devem ser misturados na mesma solução e adicionados à fatia simultaneamente.
- Adicione cerca de 1,3 μL de AAV diluído a cada fatia. Certifique-se de que a parte externa da ponta da pipeta esteja seca. Pipetar 1,3 μL de AAV diluído e segurar a pipeta acima do córtex o mais próximo possível sem tocar na fatia com a ponta da pipeta (cerca de 1 mm de distância).
- Em seguida, empurre lentamente a solução para fora da pipeta. Quando a solução tocar a fatia, mova a ponta da pipeta sobre o córtex para espalhar a solução por toda a área do córtex.
NOTA: Este procedimento deve ser feito o mais rápido possível para evitar manter as fatias fora do capô por mais tempo do que o necessário. Faça isso em um prato de cada vez e coloque o primeiro prato de volta na incubadora antes de começar no prato # 2. Para obter uma distribuição satisfatória de AAV sem danificar o tecido, é necessária alguma prática e uma mão firme.
- Se um microscópio de fluorescência vertical estiver disponível no laboratório de células, a expressão da proteína pode ser verificada durante o tempo de cultura, colocando o prato sob o microscópio.
NOTA: O prato não deve ser mantido fora da incubadora por mais de 2 a 5 minutos.
3. Imagem de lapso de tempo
NOTA: A imagem pode ser realizada sempre que os níveis de expressão dos marcadores fluorescentes forem suficientes e as fatias parecerem saudáveis (geralmente DIV11-14).
- Certifique-se de que o microscópio, a perfusão e o aquecimento estejam configurados corretamente para que a solução de imagem borbulhada seja aquecida e possa entrar e sair do banho.
NOTA: Existem várias soluções para câmaras de banho. Uma versão simples é apresentada aqui. - Faça entradas e saídas do banho com agulhas de seringa embotadas (dobradas a ~ 45 °) que são presas às laterais do banho por blu-tack / fun tack.
- Certifique-se de que a tubulação vai de um frasco de solução de imagem continuamente borbulhada através da bomba peristáltica, através do tubo de aquecimento da unidade de aquecimento e, em seguida, para a agulha da seringa de entrada no banho.
- Conecte outro tubo à saída da agulha da seringa. Este tubo então passa pela bomba peristáltica e volta para o frasco de solução de imagem (ou para um frasco de resíduos).
- Solução de imagem de bolhas com gás bióxido.
NOTA: Isso deve ser iniciado pelo menos 15 minutos antes da imagem e continuar durante todo o experimento. - Ligue a bomba peristáltica e o aquecedor e passe a solução pelo banho para obter a temperatura ideal do banho (37 ± 0.5 °C). Certifique-se de que o sensor do termômetro conectado à unidade de temperatura esteja submerso na solução do banho.
- Ligue o microscópio, a lâmpada de fluorescência e os lasers apropriados.
- Configure um caminho de luz adequado para a amostra.
NOTA: Isso varia de acordo com a configuração do microscópio e a sonda. O conhecimento geral de como usar o microscópio confocal é necessário e não será tratado aqui. - Use uma objetiva de imersão em água com ampliação e abertura numérica apropriadas (n.a.). Usamos uma objetiva apocromática plana de imersão em água de 40x (n.a. 1.0).
- Orifício aberto para obter uma seção óptica de aproximadamente 2 - 2,5 μm para o vídeo com lapso de tempo. Isso reduz a ocorrência de mitocôndrias saindo de foco durante o lapso de tempo.
- Transfira a fatia organotípica para o banho:
- Adicione uma gota de solução de imagem ou meio de cultura a uma pequena placa de Petri de plástico.
- Em um capuz estéril, use uma pinça estéril para transferir uma fatia organotípica da inserção da membrana para a gota. A pinça deve tocar apenas no confete e não na fatia.
- Tampe a placa de Petri.
- Coloque imediatamente o prato de cultura contendo o restante das fatias de volta na incubadora.
- Leve uma placa de Petri contendo a fatia ao microscópio.
- Desligue a bomba peristáltica enquanto transfere a fatia para o banho de microscópio. Primeiro, use uma pinça para levantar o confete com a fatia da placa de Petri para o topo do banho (o confete flutuará). Em seguida, coloque as duas pontas da pinça de cada lado do confete para que toquem no confete sem tocar na fatia e empurre o confete através da solução até o fundo do banho. Centralize o confete no meio do banho.
- Use uma pinça para colocar a âncora de retenção (harpa) em cima do confete sem tocar na fatia.
NOTA: Uma harpa é uma âncora de platina em forma de ferradura que é usada para evitar que a fatia flutue ou flutue no banho. Para cortes agudos, cordas finas correm de um lado da harpa para o outro (semelhante a uma harpa musical). Para fatias organotípicas, a harpa deve ser sem cordas e se ajustar ao tamanho do confete de forma que possa ficar em cima do confete sem tocar na fatia. - Ligue novamente a bomba peristáltica.
- Abaixe o objetivo até a amostra.
- Selecione a célula e a região para a imagem.
NOTA: Evite a exposição excessiva das células à luz laser, pois isso pode causar toxicidade celular (veja as dicas nos pontos abaixo). - Use as oculares e a lâmpada fluorescente para encontrar um oligodendrócito de aparência saudável com a expressão correta. Normalmente, os oligodendrócitos que têm uma forte superexpressão de proteína fluorescente parecem insalubres. Oligodendrócitos insalubres terão processos com aparência de bolhas e as mitocôndrias parecerão fragmentadas. Em oligodendrócitos saudáveis, o soma e os processos parecem suaves e as mitocôndrias têm vários comprimentos (embora sejam tipicamente muito mais curtas do que em neurônios e astrócitos).
- Coloque a célula de interesse no meio do campo de visão.
- Use a função "ao vivo" no software (para microscópios Leica e Zeiss) para identificar a célula na tela e escolha uma área de interesse, por exemplo, uma parte da célula que contém vários processos primários ou bainhas de mielina ou um único processo ou bainha de mielina.
NOTA: Para poder criar imagens do máximo possível dos processos/bainhas, escolha áreas que contenham processos relativamente planos na direção x-y. - Aumente o zoom no campo de interesse (normalmente produzindo uma imagem com um tamanho de pixel de 0,14 - 0,30 μm).
- Usando a ferramenta "regiões", desenhe um retângulo ao redor da área e escolha a opção de digitalizar apenas a região selecionada. O tempo de digitalização e, portanto, a exposição ao laser, é reduzido apenas pela digitalização da região selecionada.
NOTA: As regiões retangulares horizontais serão digitalizadas mais rapidamente do que as regiões verticais devido ao menor número de linhas digitalizadas necessárias. Se uma região de retângulo vertical for digitalizada, o tempo de digitalização pode ser reduzido girando o campo de digitalização em 90 graus (usando a ferramenta de rotação).
- Ajuste a potência e o ganho do laser para obter uma boa visão das mitocôndrias.
NOTA: Use a potência mínima do laser necessária. Se possível, aumente o ganho em vez de aumentar a potência do laser. Além de causar toxicidade celular, a potência do laser muito alta branqueará os objetos fotografados ao longo do tempo, exigindo assim um aumento adicional da potência ou ganho do laser durante a digitalização. A potência e o ganho do laser necessários dependerão do nível de expressão e do microscópio. Com um microscópio confocal LSM700, usamos um laser de 555 nm a uma potência de 20-40 μW para obter imagens dsred ou tdtomato, e um laser de 488 nm é usado a 20 - 30 μW para obter imagens GFP (potência do laser medida na abertura traseira da objetiva). O ganho é alto para imagens ao vivo, geralmente na faixa de 700 a 800 para GFP e 850-980 para dsred e tdtomato. O alto ganho pode causar mais ruído de fundo, que é removido aumentando o deslocamento digital (os valores de deslocamento normalmente ficam entre 0 e 15). Em nossa experiência, o uso de MBP_mito_GFP fornece uma melhor relação sinal-ruído do que MBP_mito_dsred. - Selecione a velocidade de digitalização.
NOTA: Minimize o tempo de digitalização utilizando uma velocidade de digitalização rápida e desenhando uma pequena região de digitalização (consulte o ponto 4.10.5 abaixo). Também é possível economizar tempo de digitalização realizando uma varredura bidirecional. No entanto, isso não é recomendado devido à qualidade de imagem inferior. - Defina a frequência e a duração da gravação de lapso de tempo, por exemplo, capture imagens a cada 2 segundos por um total de 20 minutos para imagens mitocondriais em oligodendrócitos.
NOTA: A frequência e a duração devem ser definidas de acordo com a mobilidade dos objetos de interesse. Uma frequência mais alta exporá a amostra a mais luz laser, mas objetos em movimento mais rápido também requerem uma duração total mais curta de vídeos de lapso de tempo (por exemplo, mitocôndrias em neurônios, que se movem com mais frequência e a uma velocidade muito maior do que as mitocôndrias em oligodendrócitos, são normalmente fotografadas a cada segundo por um total de 2 minutos 16 ). - Inicie a gravação com lapso de tempo.
NOTA: As mitocôndrias podem sair de foco e/ou sair da região da imagem durante a gravação. Para minimizar vibrações e movimentos, ajuste as entradas e saídas do banho e reduza a velocidade da bomba, se necessário. Pequenas mudanças no foco geralmente ainda ocorrem. Assim, é necessário o monitoramento contínuo da tela durante a imagem, com pequenos ajustes do foco durante a gravação.
Capture uma pilha z de toda a célula para identificação futura da célula e do processo de imagem.
NOTA: Para melhor resolução, o orifício deve ser redefinido para 1 unidade arejada para a pilha z.