Microscopia de dois fótons para estudar a atração do processo microglial em direção a um composto em uma fatia de cérebro de camundongo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Microscopia de dois fótons

1. Parameters setting
   1. Ligue o sistema multifotônico (detectores híbridos, laser, scanner, modulador eletro-óptico, microscópio).
   2. Ajuste o laser em 920 nm, verifique se o laser está bloqueado no modo e defina a potência em 5% - 15% e o ganho em 10%. Isso corresponde a uma potência de 3 - 5 mW sob a objetiva. Certifique-se de que os detectores não escaneados estejam engatados e que os filtros de emissão e excitação apropriados estejam instalados.
   3. Defina os parâmetros do software de imagem para os seguintes valores: para o tamanho do quadro, 1024 x 1024 pixels correspondendo a uma área de 295,07 x 295,07 μm; para o zoom, 2. Se o sinal for muito ruidoso, aplique uma média de linha de 2. Para a dinâmica de pixels, defina o software de imagem em 12 bits ou mais.
      NOTE: Imagens com um valor de bit mais alto permitem que os pesquisadores distingam diferenças menores na intensidade de fluorescência do que imagens com um valor de bit mais baixo: uma mudança de um valor de cinza em uma imagem de 8 bits corresponderia a uma mudança de 16 valores de cinza em uma imagem de 12 bits e de 256 valores de cinza em uma imagem de 16 bits. Portanto, imagens de bits mais altos são mais apropriadas para análise quantitativa, mas à medida que seu tamanho aumenta com a profundidade de bits, a capacidade de armazenamento e o poder de computação podem se tornar limitantes.
   4. Selecione o modo de varredura XYZT com uma faixa de intervalo Z de 2 μm e um intervalo T de 2 min.
      NOTE: As resoluções x, y e z são determinadas pelo teorema da amostragem de Nyquist. Um tamanho de passo Z de cerca de 0,8 seria ideal para resolver processos de microglia (com um diâmetro de <1 μm), mas a resolução óptica da microscopia multifotônica é limitante (a 920 nm com uma objetiva de 0,95 NA, a resolução axial é de cerca de 1 μm). Além dessa barreira física, em um experimento de imagem ao vivo, a sensibilidade ou relação sinal-ruído, a resolução, a velocidade e o tempo total de observação são importantes. Levando em consideração todos esses parâmetros, um passo z de 2 μm, um tamanho de imagem de 1024 x 1024 pixels e uma aquisição de alta velocidade usando um scanner ressonante acoplado a detectores HyD (leva cerca de 15 s para adquirir 50 planos z) foram selecionados aqui. A frequência de aquisições é de uma série XYZT a cada 2 minutos e a duração total é de 30 minutos. Se a configuração não for rápida ou sensível o suficiente, é possível reduzir a resolução lateral (até 512 x 512) ou o número de fatias z (criando imagens exclusivamente na profundidade z que exibe a fluorescência mais forte [i.e., não as z-slices mais profundas onde a fluorescência é fraca]), ou para diminuir a velocidade do scanner. A resolução axial também pode ser diminuída aumentando o passo z até 3 μm, mas como isso pode afetar a quantificação, todos os experimentos a serem comparados devem ser realizados com o mesmo passo z.
      NOTA: É possível realizar experimentos semelhantes em fatias de camundongos CX3CR1creER-YFP, uma linha de camundongos usada para induzir a deleção genética apenas na microglia e na qual a microglia expressa constitutivamente a proteína fluorescente amarela (YFP). No entanto, o nível de expressão de YFP é muito baixo em comparação com a proteína fluorescente verde (GFP) em CX3CR1^GFP/+ ratos; Assim, a imagem é possível, mas desafiadora e requer a otimização dos parâmetros de aquisição. Recomenda-se ajustá-los da seguinte forma.
   5. Ajuste o laser em 970 nm (que é melhor adaptado à excitação YFP do que 920 nm), a potência em 50% e o ganho em 50%, o que corresponde a uma potência de laser sob o objetivo de 5 - 6 mW.
   6. Defina uma média de linha de 4 (ou mais) para melhorar a relação sinal-ruído.
2. Posicionamento da fatia e da micropipeta de vidro, e a aplicação local do composto
   1. Conecte a bomba peristáltica à câmara de gravação, 30 min antes de iniciar a gravação. Após a limpeza de todo o sistema de perfusão com 50 mL de água ultrapura, iniciar a perfusão da câmara de registro com aCSF (50 mL) contido em um copo de vidro sob carbogenação constante. Durante todo o experimento, mantenha o aCSF circulante a 32 ° C com um microaquecedor em linha ou um aquecedor Peltier.
      NOTE: Uma câmara de perfusão específica com perfusão superior e inferior é projetada para otimizar a oxigenação em ambos os lados da fatia. A câmara de perfusão é composta por duas partes perfeitamente ajustadas, com uma malha de poliamida esticada entre elas (Figure 1A,B). Em comparação com outros tipos de câmaras, onde a fatia está diretamente colocada em uma lamínula de vidro, esta câmara reduz a morte neuronal na parte inferior da fatia, melhora a viabilidade e reduz os movimentos de corte induzidos por seu inchaço.
   2. Com uma pipeta de transferência descartável de boca larga, transfira a fatia de cérebro a ser fotografada para o béquer aCSF para remover o papel da lente, deixe-a afundar (como prova de que nenhuma bolha de ar está conectada) e transfira-a para a câmara de gravação (perfusão).
   3. Posicione um suporte de fatia (um grampo de cabelo feito de platina com os dois ramos unidos por fios de náilon paralelos) na fatia para minimizar o movimento da fatia devido ao fluxo de perfusão.
   4. Use a iluminação de campo claro para direcionar a região do cérebro de interesse (tempo de exposição: 50 a 80 ms) usando uma objetiva de baixa ampliação (5X ou 10X). Mude para a objetiva de imersão em água de maior ampliação (25x com lente de 0,35x) e ajuste a posição.
      NOTE: Evite criar imagens de campos próximos aos fios de náilon do porta-fatias, pois eles podem bloquear a luz e deformar localmente a fatia. Certifique-se de que a área de interesse seja plana. Se necessário, remova o suporte da fatia para reposicionar a fatia e/ou o suporte da fatia.
   5. Use a iluminação de fluorescência para localizar células microgliais fluorescentes a serem fotografadas em campo (tempo de exposição: 250 - 500 ms).
      NOTA: Esta etapa permite que os pesquisadores verifiquem a presença de células na região de interesse e sua intensidade de fluorescência, além de controlar a quantidade de detritos celulares.
   6. Encha a pipeta com 10 μL de aCSF com ATP, 5-HT ou o medicamento de interesse em sua concentração final. Aponte a ponta para baixo e agite suavemente a pipeta cheia de drogas para remover quaisquer bolhas de ar presas na ponta.
      NOTA: Se a solução a ser injetada tende a formar bolhas, considere o uso de pipetas de borossilicato com filamento interno. O vazamento de ATP para fora da pipeta pode atrair processos microgliais antes mesmo da injeção (se isso ocorrer, será visível na etapa de análise). Embora isso deva ser moderado com a concentração de ATP usada (500 μmol · L^-1), se for um problema, considere pré-encher a micropipeta com 2 mL de aCSF antes de adicionar a solução de ATP (ou outro composto) na etapa 1.2.6.
   7. Monte a pipeta cheia em um porta-pipeta, conectado com tubo transparente a uma seringa de 5 mL, com um êmbolo posicionado na posição de 5 mL. O próprio porta-pipetas é montado em um micromanipulador de três eixos.
   8. Sob iluminação de campo claro, use o micromanipulador para posicionar a pipeta no centro do campo. Para uma centralização reproduzível e ideal, exiba e use as réguas na imagem.
   9. Abaixe a pipeta suavemente em direção à fatia, controlando e ajustando a objetiva ao mesmo tempo até que a ponta da pipeta toque levemente a superfície da fatia. Parar a descida da pipeta assim que for visível que a fatia foi tocada permite que a ponta da pipeta penetre 80 - 100 μm da superfície da fatia (consulte Figura 2B).
   10. Ajuste o laser (veja os parâmetros acima) e mude o microscópio para o modo multifóton. Certifique-se de que a câmara esteja protegida de qualquer fonte de luz (por exemplo, uma tela de computador). Ligue os detectores não digitalizados e defina o ganho. Use uma tabela de pesquisa (LUT) com um limite superior codificado por cores para evitar a saturação dos pixels na imagem.
   11. Determine a espessura da fatia a ser fotografada (ou seja, as posições z superior e inferior onde a fluorescência é detectável [geralmente entre 220 e 290 μm no total]).
       NOTA: Na superfície da fatia, há um aumento da densidade de processos e possivelmente de microglia, muitas vezes com uma morfologia incomum, em comparação com o interior da fatia. Esse acúmulo será mais marcante com o tempo (ou seja., mais visível na última do que na primeira fatia cerebral a ser fotografada). Portanto, os planos z nos primeiros ~ 30 μm não devem ser usados para a análise e podem até ser ignorados para a aquisição.
   12. Comece a gravar por uma duração total de 30 min (ou mais, se desejar) e após uma linha de base de 5 min, aplique localmente o composto a ser testado (sem interromper a imagem). Para fazer isso, pressione lentamente o êmbolo da seringa conectada à micropipeta, da posição de 5 mL para a posição de 1 mL (em cerca de 5 s). A resistência ao pressionar o êmbolo deve ser sentida imediatamente. Caso contrário, a ponta pode estar quebrada.
       NOTE: Para um experimentador treinado, as injeções com este método são reprodutíveis, mas, alternativamente à manipulação manual de uma seringa, a pipeta pode ser conectada a um sistema automatizado de ejeção de pressão para permitir um melhor controle do volume fornecido. A injeção cria uma distorção física da fatia no local da injeção. Essa distorção é visível a posteriori nas primeiras duas ou três imagens após a injeção, mas não deve ser visível na quarta imagem (ou seja, 8 minutos após a injeção). Se persistir, considere alterar os parâmetros para a preparação da pipeta.
   13. No final da aquisição (30 min), descarte a micropipeta e retire a fatia.
   14. Antes de começar a criar uma nova fatia, faça o filme 2D (seção 2.1) para verificar se a micróglia tem uma morfologia normal e está se movendo e, portanto, se as fatias estão saudáveis.

2. Análise da Atração de Processos Microgliais

1. Projeção 2D e correção de desvio
   1. Abra o arquivo (. LIF) com Fiji.
   2. Se necessário, crie uma subpilha (Image/Stacks/Tools/Make Substack) com apenas os planos Z de interesse. Por exemplo, exclua os planos z correspondentes à superfície da fatia se tiverem sido adquiridos, mas não forem utilizados para a análise (ver a NOTA após o passo 1.2.11) e os planos z mais profundos sem fluorescência. A pilha final geralmente contém 90 - 110 fatias z (180 - 220 μm).
   3. Inicie o Z project função (Image/Stacks/Z Project") e selecione o Max Intensity tipo de projeção para fazer as projeções da pilha z adquirida a cada momento ponto.
   4. Inicie o MultiStackReg plugin (Plugin/Registration/MultiStackReg), selecionando Action 1: Align e Transformation: Rigid Body corrigir pequenos desvios que possam ter ocorrido durante a aquisição. Salve este filme 2D como um novo arquivo (.tiff).
2. Processamento de dados
   1. Abra este novo arquivo com o Icy.
   2. Desenhe um estilo circular R1 região de interesse (ROI) de 35 μm de diâmetro, centrada no local da injeção (identificada principalmente pela sombra da pipeta e pela distorção criada no momento da injeção).
   3. Use o plug-in ROI intensity evolution e meça a intensidade média ao longo tempo em R1.
   4. Salve os resultados em um arquivo .XLS.
3. Quantificação e representação dos resultados
   1. Para quantificar a resposta microglial ao longo do tempo, determine em cada ponto de tempo.
      Então, os resultados podem ser representados como uma cinética da resposta microglial ou em um ponto de tempo específico (consulte Figura 3).

Figura 1: Detalhes da câmara de interface.(A) Esboço para a impressão 3D do suporte de fatia. O diâmetro externo do suporte é de 7 cm. (B) Suporte de fatia de interface com a malha de nylon (seta) que permite aos pesquisadores manter as fatias na interface líquido-ar. (C) Dispositivo de câmara de interface que permite manter as fatias em um ambiente carbogenado (a seta indica a tubulação para borbulhar) e umidificado antes de serem fotografadas.

Figura 2: Detalhes da câmara de perfusão.(A) Esboço para a impressão 3D. O diâmetro externo da câmara de perfusão é de 5,9 cm. (B) A câmara de perfusão com a tela de náilon (seta) que sustenta a fatia, evita que ela toque na lâmina abaixo e permite que o aCSF flua acima e abaixo dela. (C) Imagem da montagem no microscópio de dois fótons. A micropipeta que irá entregar o composto localmente é visível à direita (asterisco). (D) Pipeta fotografada em campo claro. A barra de escala = 60 μm.

Figura 3: Posição da micropipeta na fatia. Exemplo de aquisição de uma pilha de imagens (no hipocampo de um animal de 30 dias) com uma micropipeta preenchida com fluoresceína (1 μM). A fluoresceína permite localizar a pipeta (asterisco) nas projeções máximas ao longo de (A) o eixo z ou (B) o eixo y. Observe no painel B que, embora mais fraca em fluorescência, também há microglia abaixo da ponta da pipeta. Neste exemplo ilustrado, a pilha completa, incluindo as imagens tiradas na parte mais superficial da fatia, foi usada para as projeções. Barra de escala = 30 μm no painel A e conforme indicado (cada graduação = 50 μm) no painel B. A espessura z da pilha = 220 μm.

Figura 4: Exemplos de experimentos abaixo do ideal.Essas fatias esperaram mais de 6 h antes da imagem e foram fotografadas desde sua superfície superior. (A) Exemplo de uma pilha z com muitos detritos (partículas fluorescentes aproximadamente redondas, mas com bordas irregulares; asteriscos) e microglia "espessa" (setas), ou seja, com processos numerosos, mas curtos. Observe os terminais de processo ampliados (pontas de seta) que se parecem com cones de crescimento axonal. A espessura z da pilha = 220 μm. Os outros dois painéis mostram duas subpilhas da mesma fatia, com (B) 1-30 planos z (espessura z = 59 μm) e (C) 30-120 planos z (espessura z = 180 μm). Nos planos superiores (mostrados no painel B), além dos grandes terminais de processo e detritos como no painel A, existem microglias com grandes corpos planos incomuns ou saliências (estrelas). Nos planos mais profundos (mostrados no painel C), não há detritos nem objetos planos, mas as células são espessas (setas) e a densidade é excepcionalmente alta. No geral, essas observações indicam que a microglia não está em um estado normal.