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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Coloração
- de Golgi-CoxImpregnação de Golgi-Cox de Cérebros
- Faça a solução de Golgi-Cox de dicromato de potássio a 1% (p/v), cromato de potássio a 0,8% (p/v) e cloreto de mercúrio a 1% (p/v) dissolvendo o dicromato de potássio e cromato de potássio separadamente em água de alta qualidade. Misturar as soluções, adicionar o cloreto de mercúrio e filtrar a solução final com papel de filtro de grau 1. Armazene a solução no escuro por até um mês.
- Anestesiar o mouse usando isoflurano a 5%.
- Eutanasiar o mouse por decapitação e remover rapidamente o cérebro.
- Coloque o cérebro em um frasco de cintilação de vidro de 20 mL contendo 17 mL de solução de Golgi-Cox e incube no escuro em RT por 25 d.
- Crioproteja o cérebro colocando-o em um tubo cônico de 50 mL contendo 40 mL de crioprotetor de sacarose (30% (p/v) de sacarose em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4) no escuro a 4 °C por 24 h.
NOTA: As três etapas opcionais a seguir podem ser empregadas como alternativa ao protocolo principal, a fim de congelar o cérebro neste estágio para armazenamento de longo prazo. - Congele todo o cérebro mergulhando-o em 200 mL de isopentano pré-resfriado em gelo seco.
- Coloque o cérebro congelado em um tubo cônico de 50 mL e guarde-o no escuro a -80 °C.
- Quando estiver pronto para prosseguir, descongele o cérebro colocando-o em um tubo cônico de 50 mL contendo 40 mL de crioprotetor de sacarose e mantendo-o no escuro a 4 °C por 24 h.
- Brain Sectioning
- Remova o cérebro da sacarose e bloqueie-o para seccionamento cortando o cerebelo usando uma lâmina de barbear e deixando uma borda plana na extremidade caudal restante do cérebro.
- Aqueça o ágar (3% (p/v) em água) até derreter e deixe esfriar até que esteja um pouco acima do ponto de fusão.
- Coloque o cérebro em um pequeno prato de pesagem descartável com a extremidade caudal voltada para baixo e adicione uma quantidade suficiente de ágar derretido para cobri-lo.
- Assim que o ágar-ágar solidificar, apare o excesso de ágar, deixando aproximadamente 2 a 4 mm ao redor do cérebro, e cole o cérebro no estágio de um vibratomo com a extremidade caudal voltada para baixo usando uma pequena quantidade de cola de cianoacrilato de etila.
- Preencha a área do palco do vibratomo com uma quantidade suficiente de crioprotetor de sacarose para cobrir o cérebro e divida o cérebro com uma espessura de fatia de 400 - 500 μm (dependendo da região do cérebro a ser examinada) usando uma frequência de vibração de 86 Hz e uma velocidade de avanço da lâmina de 0,125 mm/s.
- Usando um pincel pequeno, coloque as seções cerebrais em um poço de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços contendo inserções de fundo de malha disponíveis comercialmente e pré-preenchidas com 10 mL de sacarose a 6% (p/v) em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4.
- Incube seções no escuro a 4 °C O/N.
- Developing Brain Sections
- Transfer brain sections para um novo poço contendo 5 mL de paraformaldeído (PBD) a 2% (p/v) em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, usando as inserções de fundo de malha. Incube em um balancim, movendo-se lentamente no escuro em RT por 15 min.
- As seções devem ser lavadas duas vezes, transferindo-as para novos poços contendo 5 mL de água. Eles devem ser lavados em um balancim movendo-se a uma velocidade moderada no escuro em RT por 5 min.
- Transfira as seções para um novo poço contendo 5 mL de hidróxido de amônio a 2,7% (v/v). Incube em um balancim, movendo-se lentamente no escuro em RT por 15 min.
- As seções devem ser lavadas duas vezes, transferindo-as para novos poços contendo 5 mL de água. Eles devem ser lavados em um balancim movendo-se a uma velocidade moderada no escuro em RT por 5 min.
- Transfira as seções para um novo poço contendo 5 mL de Fixador A diluído em água 10x de sua concentração original adquirida. Incube em um balancim, movendo-se lentamente no escuro em RT por 25 min.
- As seções devem ser lavadas duas vezes, transferindo-as para novos poços contendo 5 mL de água. Eles devem ser lavados em um balancim movendo-se a uma velocidade moderada no escuro em RT por 5 min.
- Mounting Brain Sections
- Usando um pincel pequeno, monte as seções nas lâminas do microscópio. Usando uma pinça e um pequeno lenço de papel, remova o excesso de água e ágar. Certifique-se de que todo o ágar seja removido antes de prosseguir com a desidratação.
- Deixe as seções secarem ao ar em RT por aproximadamente 45 min (seções de 400 μm) ou 90 min (seções de 500 μm).
NOTA: O tempo e o nível adequado de secura são críticos e podem precisar ser determinados em cada laboratório, dependendo da temperatura e umidade ambiente. Um tempo de secagem muito curto leva à queda de seções das lâminas durante as etapas de desidratação subsequentes, e um tempo de secagem muito longo leva a rachaduras nas seções. As seções ainda parecerão brilhantes no nível apropriado de secura. - Tinga as seções com violeta cresil colocando as lâminas em frascos de coloração Coplin, conforme indicado.
NOTA: Esta etapa opcional pode ser empregada para seções que nunca foram congeladas para corar núcleos neuronais com violeta de cresila. Descobrimos que limpar e reidratar as seções antes da incubação em violeta de cresil leva a uma coloração uniforme e baixo fundo nas seções.- Coloque no agente de limpeza por 5 min. Repita uma vez.
- Coloque em etanol 100% por 5 min. Repita uma vez.
- Coloque 95% de etanol na água, depois 75% de etanol na água e 50% de etanol na água por 2 min cada.
- Coloque na água por 5 min.
- Coloque em 0,5% (p/v) de violeta cresil em água por 7 min.
- Coloque na água por 2 min. Repita uma vez.
- Desidrate as seções colocando as lâminas em frascos de coloração Coplin, conforme indicado.
- Coloque em 50% de etanol em água, depois 75% de etanol em água e 95% de etanol em água por 2 min cada.
- Coloque em etanol 100% por 5 min. Repita uma vez.
- Coloque no agente de limpeza por 5 min. Repita uma vez.
NOTA: Esses tempos de desidratação e limpeza são suficientes para processar cérebros de camundongos conforme descrito neste manuscrito. No entanto, observamos que, para outras espécies, incluindo ratos e vaqueiros, a etapa final de limpeza pode precisar ser estendida até 15 minutos no total.
- Seções de lamínula usando um meio de montagem anidro.
- Deixe os slides secarem horizontalmente no escuro em RT por pelo menos 5 d.
2. Neurônios corados com imagem em seções cerebrais espessas
- Capturando pilhas de imagens
- Ligue a lâmpada do microscópio, a câmera e o controlador de palco.
- Abra o software do microscópio (por exemplo, Neurolucida).
- Coloque uma lâmina na platina do microscópio.
- Capture uma imagem 2D de visão ampla da seção do cérebro usando uma objetiva de baixa ampliação, como 1,25X 0,4 N.A. PlanAPO ou 4X 0,16 N.A.
- Concentre-se na imagem e ajuste as configurações da câmera, incluindo o tempo de exposição e o balanço de branco.
- Crie um ponto de referência clicando com o botão esquerdo do mouse em qualquer lugar da seção
- Capture a imagem selecionando "adquirir imagem única" na janela de aquisição de imagem.
- Capture pilhas de imagens de média resolução da área que contém o(s) neurônio(s) de interesse usando uma objetiva 10X 0,3 N.A. UPlan FL N.
- Foca na imagem e ajusta as definições da câmara, incluindo a exposição e o balanço de brancos.
- Defina os limites superior e inferior da pilha de imagens focando na parte superior da seção e selecionando "definir" ao lado de "topo da pilha" na janela de aquisição de imagem e, em seguida, focando na parte inferior da seção e selecionando "definir" ao lado de "parte inferior da pilha" na janela de aquisição de imagem.
- Defina a distância do passo para 5 μm digitando "5 μm" ao lado de "distância entre imagens" na janela de aquisição de imagem.
- Capture a pilha de imagens selecionando "adquirir pilha de imagens" na janela de aquisição de imagens.
- Repita as etapas acima para capturar toda a área de interesse, garantindo que todas as pilhas de imagens se sobreponham em pelo menos 10% nos eixos X e Y.
- Capture pilhas de imagens de alta resolução da área que contém o neurônio de interesse usando uma objetiva de imersão em óleo de silicone 30X 1,05 NA.
- Aplique 3 - 4 gotas de óleo de imersão de silicone na lâmina e coloque a objetiva sobre a lâmina, garantindo o contato entre a objetiva e o óleo.
- Foque na imagem e ajuste as configurações da câmera, incluindo a exposição e o balanço de branco.
- Defina os limites superior e inferior da pilha de imagens focando na parte superior da seção e selecionando "definir" ao lado de "topo da pilha" na janela de aquisição de imagem e, em seguida, focando na parte inferior da seção e selecionando "definir" ao lado de "parte inferior da pilha" na janela de aquisição de imagem.
- Defina a distância do passo para 1 μm digitando "1 μm" ao lado de "distância entre imagens" na janela de aquisição de imagem.
- Capture a pilha de imagens selecionando "adquirir pilha de imagens" na janela de aquisição de imagens.
- Repita as etapas acima para capturar toda a área de interesse, garantindo que todas as pilhas de imagens se sobreponham em pelo menos 10% nos eixos X e Y.
- Salve o arquivo de dados e todos os arquivos de imagem no formato TIFF para processamento externo.
- Criando imagens de projeção Z e montagens de imagens
- Criar imagens de projeção Z em ImageJ
- Abra o software ImageJ que possui o plug-in Bio-Formats instalado.
- Selecione "Plugins" -> "Bio-Formats" -> "Bio-Formats Importer".
- Selecione o arquivo de pilha de imagens a ser aberto.
- Assim que o arquivo for aberto, altere o formato para RGB selecionando "Imagem" -> "Tipo" -> "Cor RGB".
- Crie a projeção Z selecionando "Imagem" -> "Stacks" -> "Z Project...".
- Salva a imagem de projeção Z bidimensional como um arquivo TIFF.
- Crie uma montagem de imagem bidimensional de toda a área de interesse.
- Abra o software (por exemplo, Adobe Photoshop).
- Selecione "File" -> "Automate" -> "Photomerge".
- Selecione "Procurar" e adicione todos os arquivos de imagem a serem mesclados.
- Certifique-se de que "Blend Images" esteja selecionado e selecione "OK".
- Salve a imagem de montagem resultante de toda a área de interesse como um arquivo TIFF.