Imagem da ativação neuronal do hipocampo em seções do cérebro de camundongos

Resumo

Fonte: Provenzano, G., et al. Visualização imuno-histoquímica da atividade dos neurônios do hipocampo após aprendizado espacial em um modelo de camundongo com distúrbios do neurodesenvolvimento. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra imagens imuno-histoquímicas para visualizar a ativação neuronal do hipocampo. Seções cerebrais coradas revelam regiões mais escuras sob um microscópio de campo claro, indicando neurônios ativados.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Imuno-histoquímica

1. Transfira 3-5 seções dorsais do hipocampo para cada camundongo em 24 placas de vários poços contendo 500 μl de solução salina tamponada com fosfato 0,1 M (PBS) para cada poço.
2. Lave as seções contidas em cada poço com 500 μl de PBS 0,1 M (5 min, 3 vezes com agitação suave).
3. Extinguir a atividade da peroxidase endógena incubando seções em peróxido de hidrogênio a 1% (H₂O₂) em PBS por 20 min com agitação suave.
4. Lave as seções em PBS 0,1 M com agitação suave (3 x 5 min).
5. Permeabilização do tecido: incubar seções por 5 min em Triton X-100 a 0,2% em PBS.
6. Durante as etapas acima (1,4; 1,5), faça tampão de bloqueio suficiente (10% de soro de cabra e 0,1% de Triton-X100 em PBS) para todo o experimento (número de seções x 100 μl x 3 etapas).
7. NOTA: Use soro da mesma espécie em que o anticorpo secundário (Ab) (conjugado à biotina) foi produzido.
8. Evitar a ligação inespecífica do anticorpo incubando secções num tampão de bloqueio (100 μl/secção) durante 1 hora à temperatura ambiente (RT) com agitação suave.
9. Incube seções em quinase regulada por sinal extracelular fosforilada de Ab primário (pERK) diluída em tampão de bloqueio durante a noite a 4 ° C, com agitação suave.
10. Lave as seções em PBS 0,1 M com agitação suave (3 x 5 min).
11. Incubar com o Ab secundário conjugado com biotina (1:250) diluído em tampão de bloqueio (o mesmo usado na etapa 1.6) por 1 hora em RT com agitação suave.
12. Prepare o reagente do complexo avidina-biotina (ABC) ao mesmo tempo, pois a avidina e a biotina requerem pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente para complexar.
13. Preparar o volume necessário de reagente ABC de acordo com o protocolo do fabricante.
14. Lave as seções em PBS 0,1 M com agitação suave (3 x 5 min).
15. Incube seções por 45 min em RT com reagente ABC.
16. Lave as seções em PBS 0,1 M com agitação suave (3 x 5 min).
17. Para preparar uma solução de trabalho de diaminobenzidina (DAB), todas as etapas envolvendo DAB devem ser feitas na capela, pois o DAB é cancerígeno e teratogênico.
18. Transfira a solução DAB para uma nova placa com uma pipeta de transferência de plástico.
19. Coloque seções na placa que contém a solução de trabalho DAB e gire lentamente a placa com a mão para permitir a exposição máxima às seções.
20. Monitore a reação DAB no microscópio até que o sinal adequado se desenvolva (2-5 min).
21. Pare a reação na intensidade de cor desejada lavando o tecido em 0,1 M PBS (3 x 5 min).
22. Use alvejante para desativar qualquer solução de substrato DAB restante na hotte durante a noite e descarte-a de acordo com as diretrizes do laboratório.
23. Monte as seções em lâminas revestidas de gelatina, flutuando-as em PBS. Em seguida, seque-os em temperatura ambiente por pelo menos 3-4 horas.
24. Desidrate as seções sequencialmente em etanol a 50%, 70%, 95% e 100% por 2 min cada e limpe em xileno a 100% por 5 min.
25. Limpe usando meio de montagem e deixe secar em uma hotte durante a noite.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
24 well plate	Sigma	CLS3524
100% etanol	Fisher Scientific	A406-20	Usado para fazer gradiente de etanol para desidratação antes da montagem da lâmina.
Xylene	VWR	66004-950	Toxic - para ser usado sob o capô. Troque o xileno todos os meses, dependendo do uso.
PBS	Sigma	P3813-10PAK
Triton X-100	Sigma	T-8787
Peróxido de hidrogênio	Sigma	H1009-100ML
Normal goat serum	Abcam	G9023-10ML
ABC kit Vectastain	Vector Laboratories	PK-6100	Adicione em um volume de 5 ml de PBS 2 gotas de reagente A, misture e, em seguida, adicione 2 gotas de reagente B e misture.
DAB peroxidase substrate	Vector Laboratories	SK-4100	Add em um volume de 5 ml de água bidestilada dupla: 2 gotas de solução de estoque tampão e misturar; 4 gotas de DAB e misturar; 2 gotas de peróxido de hidrogênio e misturar.
pERK antibody	Cell Signaling Technologies	4370	Diluição 1:500
Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody	Vector Laboratories	BA-1000	Diluição 1:250
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879
Coverslips	Fisher	12-548-B
DPX	Sigma	317616	Meio de montagem para slides. Pode ser usado meio de montagem equivalente.