Imagem da dinâmica de ATP intracelular usando sensores baseados em FRET em uma fatia de hipocampo de camundongo organotípica

Resumo

Fonte: Lerchundi, R., et. al. Imagem de ATP intracelular em fatias de tecido organotípico do cérebro de camundongo usando o sensor baseado em FRET ATeam1.03YEMK. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra o uso de sensores baseados em FRET (Transferência de Energia de Ressonância de Fluorescência) para medir os níveis intracelulares de ATP em fatias organotípicas de hipocampo de camundongos, permitindo a visualização em tempo real da dinâmica do ATP em neurônios e astrócitos em condições fisiológicas e experimentais.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Imagem ATP baseada em FRET (Figura 1)

1. Antes do experimento, prepare o E-ACSF e borbulhe-o com 95% O₂/5% CO₂ por pelo menos 30 min para obter um pH de 7,4. Ligue a fonte de luz fluorescente (lâmpada de xénon) do monocromador (figura 1

Resultados

Figura 1: Configuração da configuração de imagem FRET. (A) Ilustração esquemática dos diferentes componentes e seu arranjo espacial necessário para a configuração da imagem FRET. .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-desoxiglicose	Alfa Aesar	L07338	Análogo
Filtros de passagem de banda 483/32	AHF Analysentechnik AG		Filtro
Filtros de passagem de banda 542/27	AHF Analysentechnik AG		Filtro de emissão compatível com divisor
Divisor de feixes T 455 LP	AHF Analysentechnik AG		Excitation dichroic mirror
Beamsplitter T 505 LPXR	AHF Analysentechnik AG		Splitter dicroico
Processamento de dados Origin Pro 9.0.0 (64- bit)	OriginLab corporation		Software
D-glucose monohydrate	Caelo	2580-1kg
DPBS	GIBCO/Life	14190250	Dulbecco's phosphate-buffered salina
Microscópio vertical Eclipse E 600FN	Nikon Microscope Solutions
Microscópio vertical Eclipse FN1	Nikon Microscope Solutions
Experimental chamber	custom build		Câmara de perfusão para imagens de células vivas
Hanks' Balanced Salt solution	Sigma-Aldrich	H9394	Com Vermelho de Fenol para monitoramento de
Minimum Essential Medium Eagle	Sigma-Aldrich	M7278	Synthetic cell culture media
Monocromator Polychrome V	Thermo Scientific/FEI		Ultra rápido monocromador de comutação
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0	Nikon Microscope Solutions		Objetiva de microscópio de imersão em água	NIS Elements 4.50 advanced Research	Nikon Microscope Solutions
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics		Câmera
Tubo de perfusão	Pro Liquid GmbH		Tygon tubing, 1,52 x 322 mm (Wd: 0,85)
Photoshop CS 6 Versão 13.0	Adobe		Software
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)	ETH Zürich	v244	Vetor AAV de fita simples que induz a expressão de ATeam1.03YEMK sob o controle do fragmento promotor da sinapsina 1 humana hSyn1.
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)	ETH Zürich	v307	Vetor AAV de fita simples que induz a expressão de ATeam1.03YEMK sob o controle do fragmento promotor de proteína ácida fibrilar glial humana ABC1D.

de glicose não metabolizável de emissão compatível com divisor de análise de dados e gráficos científicos pH >Software de imagem. Versão atualizada para imagem FRET digital CMOS de processamento de imagem