Imagem da dinâmica de ATP intracelular usando sensores baseados em FRET em uma fatia de hipocampo de camundongo organotípica

Resumo

Fonte: Lerchundi, R., et. al. Imagem de ATP intracelular em fatias de tecido organotípico do cérebro de camundongo usando o sensor baseado em FRET ATeam1.03YEMK. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra o uso de sensores baseados em FRET (Transferência de Energia de Ressonância de Fluorescência) para medir os níveis intracelulares de ATP em fatias organotípicas de hipocampo de camundongos, permitindo a visualização em tempo real da dinâmica do ATP em neurônios e astrócitos em condições fisiológicas e experimentais.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Imagem ATP baseada em FRET (Figura 1)

1. Antes do experimento, prepare o E-ACSF e borbulhe-o com 95% O₂/5% CO₂ por pelo menos 30 min para obter um pH de 7,4. Ligue a fonte de luz fluorescente (lâmpada de xénon) do monocromador (figura 1). Inicie a perfusão antes de retirar a fatia da incubadora.
   NOTA: Mantenha a solução salina borbulhando com 95% de O₂ e 5% de CO₂ durante todo o experimento.
2. Transfira a fatia para uma câmara experimental que é constantemente perfundida com E-ACSF recém-carbogenado usando uma bomba peristáltica (Figura 1). Em seguida, fixe a fatia com uma grade. Coloque a câmara no microscópio stage e conecte o sistema de perfusão. Tubos de laboratório à prova de gás são recomendados para perfusão.
   NOTA: Os experimentos podem ser realizados à temperatura ambiente ou perto da temperatura fisiológica, dependendo do projeto experimental. Verificar a estabilidade e confiabilidade do fluxo de perfusão para evitar mudanças de foco induzidas pelo movimento do tecido e/ou alterações na tensão de cisalhamento. As velocidades de perfusão padrão para o trabalho de corte, usadas por nós e por muitos outros laboratórios, são de 1,5 a 2,5 mL / min.
3. Traga a fatia cultivada em foco usando uma luz de transmissão. Identificar a área onde as experiências devem ser realizadas (por exemplo: a região CA1 do hipocampo). Antes de iniciar os experimentos de imagem, espere pelo menos 15 minutos para permitir que as fatias se adaptem às condições salinas. Para a configuração da configuração experimental, consulte a Figura 1.
4. Ligue a câmera e o software de imagem. Em seguida, selecione o cubo de filtro adequado.
5. Excite a proteína fluorescente doadora (eCFP) a 435/17 nm (~435 nm). Defina o tempo de exposição entre 40 a 90 ms.
   NOTA: A forte exposição de fatias à luz fluorescente pode resultar em efeitos fototóxicos.
6. A excitação a 435 nm resulta em emissão a 475 nm (eCFP; doador) e 527 nm (Vênus; aceitador). Divida a emissão de fluorescência em 500 nm com um divisor de imagem de emissão e empregue filtros passa-banda em 483/32 e 542/27 para isolar ainda mais a fluorescência do doador e do aceitador. A expressão forte pode resultar na saturação dos detectores. Nesse caso, você pode usar um filtro de densidade neutra para reduzir a intensidade da excitação.
7. Selecione uma região de interesse (ROI) aparentemente desprovida de fluorescência celular para subtração de fundo. Em seguida, crie ROIs delineando corpos celulares.
8. Defina a frequência de aquisição da imagem e o tempo total de gravação. Para experimentos longos (>30 min), recomenda-se uma frequência de aquisição de 0,2-0,5 Hz para evitar fototoxicidade.
9. Inicie a gravação. Recomenda-se registrar pelo menos 5 min em condições basais para garantir a estabilidade da preparação.
   NOTA: Ajuste o foco da célula durante a gravação, se necessário.

Resultados

Figura 1: Configuração da configuração de imagem FRET. (A) Ilustração esquemática dos diferentes componentes e seu arranjo espacial necessário para a configuração da imagem FRET. ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-desoxiglicose	Alfa Aesar	L07338	Análogo
Filtros de passagem de banda 483/32	AHF Analysentechnik AG		Filtro
Filtros de passagem de banda 542/27	AHF Analysentechnik AG		Filtro de emissão compatível com divisor
Divisor de feixes T 455 LP	AHF Analysentechnik AG		Excitation dichroic mirror
Beamsplitter T 505 LPXR	AHF Analysentechnik AG		Splitter dicroico
Processamento de dados Origin Pro 9.0.0 (64- bit)	OriginLab corporation		Software
D-glucose monohydrate	Caelo	2580-1kg
DPBS	GIBCO/Life	14190250	Dulbecco's phosphate-buffered salina
Microscópio vertical Eclipse E 600FN	Nikon Microscope Solutions
Microscópio vertical Eclipse FN1	Nikon Microscope Solutions
Experimental chamber	custom build		Câmara de perfusão para imagens de células vivas
Hanks' Balanced Salt solution	Sigma-Aldrich	H9394	Com Vermelho de Fenol para monitoramento de
Minimum Essential Medium Eagle	Sigma-Aldrich	M7278	Synthetic cell culture media
Monocromator Polychrome V	Thermo Scientific/FEI		Ultra rápido monocromador de comutação
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0	Nikon Microscope Solutions		Objetiva de microscópio de imersão em água	NIS Elements 4.50 advanced Research	Nikon Microscope Solutions
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics		Câmera
Tubo de perfusão	Pro Liquid GmbH		Tygon tubing, 1,52 x 322 mm (Wd: 0,85)
Photoshop CS 6 Versão 13.0	Adobe		Software
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)	ETH Zürich	v244	Vetor AAV de fita simples que induz a expressão de ATeam1.03YEMK sob o controle do fragmento promotor da sinapsina 1 humana hSyn1.
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)	ETH Zürich	v307	Vetor AAV de fita simples que induz a expressão de ATeam1.03YEMK sob o controle do fragmento promotor de proteína ácida fibrilar glial humana ABC1D.

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