Imagem in vivo de dois fótons da retina de camundongos

Resumo

Fonte: Wang, Z., et al. Imagem in vivo de dois fótons transpupilares da retina de camundongos. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra uma técnica para imagens de retina in vivo usando microscopia de dois fótons. Os camundongos anestesiados são preparados para a imagem prendendo suas cabeças, aplicando lubrificante ocular e colocando uma lamínula sobre o olho. As células ganglionares da retina (RGCs) que expressam proteínas fluorescentes são visualizadas pela primeira vez usando epifluorescência para alinhamento. Finalmente, a imagem de dois fótons é empregada, permitindo a visualização de alta resolução de RGCs.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação do mouse para aquisição

1. de imagemAnesthetizing mouse for imaging
   NOTA: Para mitigar a exposição ao isoflurano, garanta a eliminação adequada dos gases residuais. Certifique-se de que a porta de exaustão da câmara de indução de anestesia esteja conectada a um recipiente de filtro de gás de limpeza passivo e a saída do porta-objetivas de anestesia de camundongo esteja conectada a um recipiente de filtro de gás de limpeza ativo com um vácuo fornecido por um aparelho de evacuação de gás. Siga as diretrizes do fabricante para monitorar o peso do recipiente do filtro para substituição.
   1. Anestesiar o mouse usando o coquetel de cetamina/xilazina. Alternativamente, induza a anestesia por inalação de isoflurano se também estiver usando isoflurano para manutenção da anestesia (sessão de imagem > 30 min). Defina o dispositivo de anestesia para pequenos animais para encher a câmara de indução com isoflurano a 5% misturado com ar ambiente a uma taxa de fluxo de 0.5 L/min. Coloque o mouse na câmara de indução e aguarde 15 s para que o mouse fique anestesiado.
   2. Mude o vaporizador de isoflurano para 0% e direcione o fluxo de anestesia para o revólver. Execute uma "descarga de O₂" de 5 segundos da câmara de indução. Retire o mouse da câmara de indução e prenda-o no suporte da cabeça, prendendo o revólver.
   3. Use uma mistura de isoflurano a 1% com ar ambiente a uma taxa de fluxo de 0,5 L/min para manutenção da anestesia. Monitore a frequência respiratória em intervalos de 5 minutos durante a anestesia, ajustando a porcentagem de isoflurano para manter uma frequência respiratória de ~ 60 respirações / min.
      NOTA: Essas configurações (% isoflurano, taxa de fluxo) também podem ser usadas para a manutenção da anestesia induzida pelo coquetel de cetamina/xilazina.
2. Pupil dilatation
   1. Prepare uma solução de 1% p/v de atropina e 2,5% p/v de cloridrato de fenilefrina em água. Armazene a solução dilatadora à temperatura ambiente e protegida da luz.
   2. Usando um conta-gotas de pipeta descartável, aplique uma gota da solução dilatadora em cada olho que será fotografado. Apague as luzes da sala e espere 5 minutos para que a pupila dilate. Quando a pupila estiver dilatada, seque a solução dilatadora com tecido sem fiapos.
      NOTA: Certifique-se de que a solução dilatadora não entre nas narinas.
   3. Aplique uma grande gota de gel lubrificante para os olhos em cada olho que será fotografado. Se ambos os olhos forem fotografados, aplique um pequeno pedaço de filme plástico sobre o gel ocular no olho sem imagem para evitar a desidratação. Se estiver apenas fotografando um olho, aplique pomada lubrificante para os olhos no olho que não será fotografado.
3. Posicionando o mouse para imagens
   1. Para prender o mouse no suporte da cabeça de imagem, gire o braço principal do suporte da cabeça até que a barra do fone de ouvido esteja inclinada em um ângulo de 60° ou mais abaixo da horizontal. Prenda o pino do canal auditivo inferior na posição estendida para dentro e o pino do canal auditivo superior na posição retirada.
   2. Com o mouse voltado para a barra de mordida, monte uma orelha no pino inferior estendido, inserindo o pino no canal auditivo. Afrouxe o parafuso que prende o pino do canal auditivo superior e estenda o pino para o outro canal auditivo. Aperte o parafuso para prender a cabeça.
   3. Deslize a barra de mordida em direção à cabeça do mouse. Eleve suavemente a cabeça do mouse e, em seguida, abaixe os incisivos superiores do mouse no orifício da barra de mordida. Retraia a barra de mordida com força suave para prender a cabeça do mouse e prenda a posição da barra de mordida apertando o parafuso.
   4. Se estiver usando isoflurano, deslize o revólver através de sua ranhura na barra de mordida antes de prender os incisivos do mouse. Prenda e aperte a posição da barra de mordida como na etapa 1.3.3. Aperte o revólver usando os dois parafusos em sua face superior até que ele se encaixe perfeitamente no nariz do mouse, mas não contraia o focinho.
   5. Transfira o mouse, no suporte da cabeça, para o microscópio stage abaixo da objetiva. Gire o braço principal do suporte da cabeça até que a pupila do olho esteja orientada para cima, alinhada com o caminho da luz (Figura 1).
   6. Coloque uma lamínula #1.5 no suporte do filtro compacto e prenda o suporte ao microscópio stage. Abaixe a lamínula em direção ao olho, entrando em contato com o gel lubrificante para os olhos, de modo que fique horizontalmente imediatamente acima da córnea (Figura 1). Certifique-se de que a lamínula não toque na córnea.
      NOTA: No microscópio, certifique-se de que o caminho da luz de excitação esteja definido para epifluorescência e o caminho da luz de emissão esteja definido para a ocular. Ligue o iluminador de epifluorescência em sua potência mais baixa e abra o obturador do iluminador. Escolha o comprimento de onda do iluminador de epifluorescência e o filtro de fluorescência correspondente ao fluoróforo que está sendo fotografado.
   7. Manobre o stage nas dimensões X-Y e a objetiva na posição Z usando o stage controle e o acionamento de foco motorizado até que a luz de excitação de campo amplo cubra totalmente a córnea. Olhando pela ocular, continue a ajustar a posição Z do estágio até que as células ou estruturas fluorescentes da retina entrem em foco. Aumente a potência do iluminador de epifluorescência se o sinal da amostra não for suficientemente brilhante para resolver células ou estruturas individuais de interesse através da ocular.
      NOTA: Se tiver problemas para localizar a retina, a íris é um ponto de referência de alto contraste para ancorar e, em seguida, focar em direção à retina. Esta etapa também permitirá verificar se a pupila está dilatada ao máximo.
   8. Obtenha uma área de imagem no eixo com a lente do mouse. Ajuste o ângulo do mouse usando os vários graus de liberdade no suporte da cabeça até que ocorra apenas a expansão ou contração da luz fora de foco ao ajustar o plano focal. Desligue o iluminador de epifluorescência e feche o obturador do iluminador.
      NOTA: A paralaxe X-Y significativa da luz fora de foco ao rolar pelos planos focais da direção Z indica que a retina não está no eixo em relação ao caminho da luz de imagem.

2. Aquisição

1. de imagem de dois fótonsParâmetros de configuração e aquisição de imagem
   NOTA: Desligue as luzes da sala e cubra as fontes de luz dispersas da sala. Certifique-se de que o iluminador de epifluorescência esteja desligado e que o obturador do iluminador esteja fechado.
   1. Mude o caminho da luz de excitação para o laser e o caminho da luz de emissão para os tubos fotomultiplicadores (PMTs).
   2. No software de aquisição de imagens, defina um tamanho de quadro de 512 x 512 e uma média de quadros de 3. Defina os passos por fatia para -8 μm. Designe o passo z para começar no topo da pilha e progredir para baixo, minimizando a ativação dos fotorreceptores pelo laser de dois fótons.
      NOTA: O tamanho do passo pode ser reduzido para aumentar a resolução Z a um custo de maior tempo de imagem, mas passos de 8 μm são suficientes para resolver o somata celular nesta configuração de imagem.
   3. Ligue e habilite os PMTs. Ajuste o PMT voltage para 680 V. Habilite o obturador de excitação.
      NOTA: PMTs energizados são suscetíveis a danos leves. Certifique-se de que o iluminador de epifluorescência esteja desligado, a cortina do gabinete do microscópio esteja fechada e as luzes da sala estejam apagadas.
   4. Inicie uma visualização de imagem ao vivo do tecido alvo, começando com 1% de potência do laser. Ajuste automaticamente o brilho da tela para visualizar as células ou estruturas de interesse. Ajuste automaticamente a fase de digitalização. Se o tecido alvo estiver escuro ou pouco claro, aumente a porcentagem de potência do laser até que as estruturas se tornem visíveis sem ultrapassar o limite definido na etapa 2.4.4, que corresponde a 45 mW.
      NOTA: Para uma imagem de 16 bits, um valor de exibição de ~1000 ao ajustar automaticamente o brilho em um plano Z contendo estruturas de interesse indica brilho suficiente da amostra.
   5. Manobre a platina do microscópio na direção X-Y para centralizar em uma área de imagem desejada e, em seguida, navegue até o plano Z com as estruturas de interesse em foco.
      NOTA: A imagem adjacente à cabeça do nervo óptico permite que ela sirva como um ponto de referência inequívoco para experimentos de imagem crônica.
   6. Se este for um experimento crônico de lapso de tempo, abra uma imagem anterior no computador de aquisição e use-a como referência para encontrar a mesma área de interesse. Certifique-se de que o ângulo da imagem seja semelhante ao das imagens anteriores para adquirir o mesmo conjunto de células com paralaxe mínima.
      NOTA: Para criar imagens das mesmas células dos pontos de tempo anteriores (Figura 2), é provável que seja necessário um ajuste adicional da posição da cabeça do mouse.
   7. Defina os limites Z da pilha de imagens navegando até os planos Z superior e inferior de interesse e adquira a imagem. Após a conclusão da aquisição da imagem, desative os PMTs e o obturador de emissão. Mude o caminho da luz de emissão de volta para a ocular e o caminho da luz de excitação para a iluminação de epifluorescência. Remova o mouse da platina do microscópio.

Resultados

Figura 1: Posicionamento de camundongos para imagens in vivo. Para posicionar o mouse com a pupila no eixo com o caminho da luz, o mouse anestesiado é primeiro contido em um suporte de cabeça, a cabeça é girada e inclinada, uma grande gota de gel lubrificante para os olhos é colocada no olho e o mouse é colocado no palco. Uma lamínula é montada no s...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
#1.5 lamínula	ThermoFisher	152440	Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm
50 mL	Agulha	cimentada	80950
Anesthesia Air Pump	RWD Life Science	R510-30
Atropine	Sigma	A0132	Para solução
Basic Small Animal Anesthesia	RWD Life Science	R500IE
Capilar de vidro borossilicato	Sutter	B150-86-10	Diâmetro externo 1,50 mm, diâmetro interno 0,86 mm, comprimento 10 cm
CFP/YFP cubo de filtro	Chroma	custom	480/40, 505 long pass, 535/30
ChromoFlex - Unidade de detecção PMT de dois canais	Scientifica	S-MPLG-1002
Bomba de aquecimento circulante	Braintree Scientific	tp-700	Ajustado para 37 °C
Filme plástico	VWR	10713-916
Suporte de filtro compacto	ThorLabs	DH1	Segura lamínula sobre o olho
Cx3cr1-GFP ratos transgénicos (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J)	The Jackson Laboratory	5582
Chassis do controlador DAQ	National Instruments	PXIe-1073
Dispositivo de aquisição de dados	National Instruments	BNC-2090A
Módulo FPGA com digitalizador	National Instruments	NI-5734
Aparelho de evacuação de gás	RWD Life Science	R546W
GenTeal Severe gel lubrificante para os olhos	Alcon	(da farmácia local)	Para uso durante a imagem
GFP/Red cubo de filtro	Chroma	custom	535/30, 560 long pass, 605/70
Almofada de aquecimento	McKesson Medical and Surgical	190147
HyperScope Launch Optics para uso com Pockels Cell	Scientifica	S-MP-101080
HyperScope Módulo principal	Scientifica	S-MP-100466
HyperScope Scan Path	Scientifica	S-MP-100406
HyperScope X galvo Module	Scientifica	MP-100443
ImageJ Fiji software		Freeware
Isoflurane	Patterson Veterinary	NDC 14043-704-06
Filtro de gás Isoflurano (limpeza ativa)	RWD Life Science	R510-31
Recipiente de filtro de gás Isoflurano (limpeza passiva)	RWD Life Science	R510-31S
cetamina HCl (100 mg/mL)	Vedco	NDC 50989-161-06
M32 para adaptador M26	ThorLabs	M32M26S
MaiTai GUI software	Spectra-Physics	NA
MATLAB software	MathWorks	NA	R2015b
meloxicam (5 mg/mL)	Analgésico	Boehringer Ingelheim	NDC 0010-6013-01
extrator de micropipeta Sutter Flaming/Brown Modelo P-97	Óleo mineral Fisher BP2629-1
Mini bulldog hemostatic clamp	Ferramentas de Fine Science	18053-28
Tubulação EVA Miniatura 0.02" ID, 0.06" OD	McMaster Carr	1883T1
Tubulação EVA Miniatura 0.05" ID, 0.09" OD	McMaster Carr	1883T4
Suporte de cabeça de mouse	Narishige	SGM-4
No. 5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10
Optic Posts 1/2"	ThorLabs	TR3-P5
Kit de medidor de potência óptica	ThorLabs	PM100D
pE-300 Ultra LLG Deivery	Scientifica	COO-LED3ULLGs
Cloridrato de fenilefrina	Sigma	P6126	Para solução
Pockels cell	Conoptics	350-80-02
Pockels cell amplifier	Conoptics	Model 302RM
Cloridrato de proparacaína	Sigma	1571001	Para imobilização
Red & Far Red filtro de passagem curta Cube	Chroma	custom	560 short pass
Rotating 1/2" post clamp	ThorLabs	SWC
ScanImage package	Vidrio Technologies	Freeware	Software de aquisição de imagem; Versão 5.4.0 (2018); requer MATLAB
solução de cloreto de sódio, estéril (0.9%)	Fresenius Kabi	NDC 63323-186-01
Stereomicroscope	Leica	S9 E
Centrífuga de mesa	Oxford	Benchmate C8
Terramicina oxitetraciclina/antibiótico polimixina B pomada oftálmica	Zoetisus	NA	Para uso após injeção
Sistema de resfriamento ThermoRack	Sistemas de resfriamento de estado sólido	ThermoRack 401	Definido para 20 °C
Ultrafast Ti:Laser de safira	Spectra-Physics	Mai Tai DeepSee
Camundongos transgênicos Vgat-Cre (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)	O Laboratório Jackson	16962
VGlut2-Cre camundongos transgênicos (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J)	The Jackson Laboratory	16963
VivoScope for In Vivo Imaging	Scientifica	S-MPVS-1200-00P
White petrolatum-mineral oil lubricant eye ointment	Stye	NA	For use após imagem
xylazine HCl (20 mg/mL)	Akorn	NDC 59399-110-20

Hamilton 22G dilatadora da pupila Device do rato <td style='height:15.75pt;'>Micorscope Objective Edmund Optics 46-404 Mitutoyo WE715042319 dilatadora da pupila ocular intravítrea