Imagem de fluorescência da dinâmica neuroimune usando um implante de crânio

Resumo

Fonte: Bisht, K., et al. Mapeamento cerebral preciso para realizar imagens repetitivas in vivo da dinâmica neuroimune em camundongos. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra imagens de fluorescência da dinâmica neuroimune em um camundongo transgênico com implante de crânio. A estabilidade vascular e neuronal é visualizada juntamente com as alterações microgliais dinâmicas, refletindo as respostas imunes à atividade neuronal.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação do mouse para implantação

da janela cranianaNOTA: Várias linhagens de camundongos transgênicos com tags fluorescentes são adequadas para imagens.

1. Use camundongos CX3CR1GFP/+ para visualizar a microglia in vivo. Normalmente, são usados camundongos juvenis a adultos jovens de 4 a 10 semanas de idade que pesam 17-25 g.
   NOTA: Embora essa abordagem seja adequada até mesmo para camundongos pré-desmamados, a necessidade de devolver os camundongos às gaiolas com suas mães para alimentação pode complicar a recuperação se a mãe não cuidar adequadamente dos filhotes após a cirurgia. Portanto, recomenda-se o uso de camundongos pós-desmame.
2. Anestesiar o camundongo usando isoflurano (fluxo de 5% em oxigênio para indução por 1 min) em uma câmara anestésica. Verifique se o mouse não mostra nenhum movimento ou resposta de espasmos aos beliscões dos dedos dos pés e/ou da cauda. Retire o mouse da câmara e, ao ar livre, raspe bem o cabelo da cabeça entre as orelhas, desde o nível dos olhos até o topo da região do pescoço, usando um aparador de cabelo.
   NOTA: A concentração de isoflurano utilizada dependeria do tamanho da câmara de indução. Portanto, para câmaras menores, o isoflurano a 3-4% pode ser usado para induzir anestesia com eficácia, enquanto câmaras maiores exigirão até 5%.
3. Mova o mouse para o cone do nariz da estação de cirurgia estereotáxica para anestesia (1,5-2% para manutenção durante a cirurgia), estabilize sua cabeça usando barras auriculares e mantenha o mouse em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal aquecida.
4. Lubrifique os dois olhos com pomada para os olhos. Injete 100 μL de bupivacaína a 0,25% (para fornecer analgesia local ao camundongo que durará 8-12 h) e 100 μL de dexametasona 4 mg / mL (para reduzir a inflamação que pode resultar do procedimento cirúrgico) por via subcutânea no local da incisão. Deixe o mouse descansar por pelo menos 5 minutos antes de passar para a próxima etapa.
5. Limpe a cabeça raspada com três cotonetes alternados de betadine e álcool 70%. Usando uma lâmina cirúrgica ou tesoura, faça uma incisão no couro cabeludo na linha média que se estende da parte de trás da região do crânio entre as orelhas até a área frontal entre os olhos. A pele restante é cortada para expor o crânio.
6. Limpe o tecido conjuntivo localizado entre o couro cabeludo e o crânio subjacente com peróxido de hidrogênio a 3% (H₂O₂) e localize a área do cérebro a ser visualizada com coordenadas estereotáxicas.
   NOTA: Freqüentemente, há algum sangramento (etapa 1.5) da incisão na superfície do crânio. Esse sangramento geralmente se resolve sozinho em 3-5 minutos. A limpeza com o peróxido ajuda. O tratamento prévio com bupivacaína (etapa 1.4) também limita a quantidade de sangramento durante esse período.

2. Cirurgia de implantação de janela craniana de camundongo

1. Perfure uma abertura circular ~4 mm no crânio usando uma broca dentária (0,7 mm de diâmetro da ponta) e remova cuidadosamente esta parte do crânio usando uma pinça pontiaguda. Para obter imagens do córtex somatossensorial de camundongos de 6 a 8 semanas de idade, localize o centro da craniotomia em -2,5 posterior e ± 2,0 lateral ao bregma. Durante a perfuração, umedeça regularmente o crânio com soro fisiológico estéril e cotonetes para resfriar o cérebro, limpar os detritos ósseos e amolecer o osso do crânio para eventual remoção.
   NOTA: As coordenadas da craniotomia variam dependendo da região de interesse e da idade dos camundongos.
2. Depois de remover o crânio, coloque cuidadosamente uma pequena lamínula (tamanho #0 com 0,1 ± 0,02 mm de espessura) umedecida com solução salina na craniotomia. Seque o excesso de solução salina usando um lenço estéril.
3. Usando um aplicador pontiagudo (como uma ponta de pipeta ou a ponta pontiaguda de um cotonete de madeira quebrado), aplique a cola de cianoacrilato ao redor da janela e deixe-a se prender ao cérebro e ao crânio. Aplique a cola primer no resto do crânio e catalise com uma luz de polimerização por 20-40 s. Prepare um poço ao redor da janela com a cola final e catalise com uma luz de cura de 20-40 s.
4. Cole uma pequena placa de cabeça no crânio no hemisfério contralateral da craniotomia primeiro com a cola primer como primer e depois com a cola final. Catalise ambos com a luz de polimerização por 20-40 s cada.
   NOTA: As suturas são desnecessárias se o crânio estiver coberto com cola durante este procedimento.

3. Cuidados pós-operatórios

1. Permita que o mouse acorde sem anestesia (a recuperação feita em uma almofada de aquecimento reduz o tempo de recuperação) e devolva-o à sua gaiola doméstica quando estiver totalmente acordado. Injete uma dose subcutânea de buprenorfina SR (0,5 mg / kg) como analgesia pós-operatória suficiente para 72 h.
2. Para facilitar uma recuperação saudável da cirurgia, forneça ao camundongo alimentos extramacios, como ração sólida regular embebida em água para amolecê-la ou comida na forma de gel.
   NOTA: Uma única quantidade de alimentos macios imediatamente após a cirurgia é suficiente.
3. Monitore o mouse diariamente quanto à saúde e recuperação adequada nas primeiras 72 h do procedimento cirúrgico. Posteriormente, a imagem da cirurgia de implantação da janela será realizada em até 2 semanas.
   NOTA: Se bem feito, os camundongos se recuperam bem mostrando comportamentos ambulatoriais normais, exploração suficiente da gaiola, boa hidratação, ganho de peso estável e extensas interações com outros camundongos na gaiola e outros itens na gaiola. Os camundongos que apresentam letargia, desidratação e perda de peso superior a 10% após a cirurgia são sacrificados e removidos do estudo.

4. Mapeamento cerebral de dois fótons para imagem inicial

1. Anestesiar o camundongo (isoflurano, 5% de indução e 1,5% de manutenção). Estabilizar a cabeça usando parafusos para montar a placa de cabeça no estágio do microscópio de dois fótons, sendo mantida em uma placa de aquecimento a 35 °C. Injetar intraperitonealmente 100 μL de corante de vaso sanguíneo, como Rodamina B (2 mg/mL).
   NOTA: A imagem também pode ser feita em camundongos acordados sem anestesia. No entanto, estudos recentes indicam que a anestesia afeta a dinâmica da vigilância microglial. A fixação da cabeça para imagens de dois fótons em camundongos acordados aumenta o estresse mesmo durante imagens crônicas por pelo menos 25 dias.
2. Limpe a superfície da janela craniana suavemente usando um cotonete embebido em etanol a 70%. Coloque algumas gotas de água ou soro fisiológico na janela craniana e abaixe a lente objetiva na solução, pois a objetiva é uma lente de imersão.
3. Desenhe à mão um mapa grosseiro para denotar os principais pontos de referência dos vasos sanguíneos em um caderno de laboratório enquanto olha através da ocular por epifluorescência. Use este desenho para identificar as regiões específicas durante a aquisição de imagens de dois fótons. Como alternativa, tire fotos dos vasos sanguíneos por meio de uma câmera instalada no microscópio ou por meio de uma câmera portátil ou telefone.
   NOTA: Essas imagens e imagens desenhadas à mão são para facilitar a revisitação das mesmas regiões amplas sob o microscópio antes de duas imagens de fótons. Estes não são mapeamentos de imagem precisos.
4. Sob duas imagens de fótons, colete imagens de células e vasos fluorescentes conforme necessário. Faça anotações cuidadosas com coordenadas apropriadas para garantir que as regiões precisas possam ser revisitadas para imagens subsequentes. Colete vários campos de visão nesta sessão inicial de imagem, por exemplo, adquira imagens de pilha z a cada 1-2 μm através de um volume de tecido.
   NOTA: Ao coletar imagens por dois fótons, os pontos de referência dos vasos sanguíneos são usados para mapeamento grosseiro. Se for necessário um mapeamento fino, dendritos marcados com YFP de camundongos Thy1-YFP são usados.
   1. Use estes parâmetros recomendados para a obtenção de imagens: um comprimento de onda de 880-900 nm é o ideal; para excitação GFP e/ou dsRed / Rhodamine, é usado um espelho dicróico de 565 nm com filtros de emissão de 525/50 nm (canal verde) e 620/60 nm (canal vermelho); para separação GFP e YFP, é usado um espelho dicróico de 509 nm com filtros de emissão de 500/15 e 537/26 nm; a potência no cérebro é mantida em 25 mW ou menos; a resolução da imagem é de 1024 x 1024 pixels, o campo de visão obtido com uma objetiva de 25X 0,9 NA com um fator de zoom de 1,5X é de 295,24 x 295,24 μm.
5. No final da imagem, retire o mouse do palco, deixe-o acordar da anestesia e retornar à sua gaiola de origem até uma futura sessão de imagem.

5. Imagem de dois fótons e re-imagem

1. Para futuras sessões de imagem subsequentes, que podem durar de algumas horas a meses após a sessão de imagem inicial, anestesiar o camundongo (isoflurano, indução a 5% e manutenção a 1,5%), montar no microscópio de dois fótons, manter em uma placa de aquecimento e reinjetar 100 μl de um corante de vaso sanguíneo, como a rodamina B (2 mg/ml).
2. Abra as imagens obtidas anteriormente no ImageJ e, usando essas imagens, bem como as notas da sessão anterior, identifique as áreas com imagens anteriores e re-imagine cuidadosamente
3. Repita isso enquanto a janela de imagem estiver clara ou essencial para a extensão do estudo.

Materiais

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Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Coverglass (3mm)	Warner Instruments	64-0726
Cola de cianoacrilato (Krazy Glue)	Amazon	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2
Demi Ultra LED Curing Light System	Dental Health Products, Inc	910860-1
Dental Drill	Osada: www.osadausa.edu	EXL-M40
Broca	#19008-07
Eye Ointment	Henry Schien	1338333
iBond Total Etch (cola primer)	Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)	66040094
Rhodamine B	Millipore Sigma	81-88-9 (R6626)<
Tetris Evoflow glue (Final glue)<	#595956
Wahl Brav Mini+	Amazon	https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1