Imagem de fluorescência da dinâmica do cálcio nas junções neuromusculares no diafragma de um camundongo transgênico

Resumo

Fonte: Heredia, D. J., et. al. Imagem ex vivo da sinalização de cálcio específica da célula na sinapse tripartida do diafragma do camundongo. J. Vis. exp.}} (2018)

Este vídeo demonstra imagens de fluorescência Caracterização da dinâmica do cálcio nas junções neuromusculares (NMJs) em um camundongo transgênico que expressa indicadores de cálcio geneticamente codificados. Um NJM é identificado por receptores de acetilcolina marcados com fluorescência no diafragma com o nervo frênico. Um divisor de imagem é usado para visualizar vários sinais simultaneamente. Um estímulo elétrico é fornecido e a mudança na fluorescência na JNM em resposta ao influxo de cálcio é registrada.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Preparação dos diafragmas e nervos frênicos de camundongos transgênicos

1. Compre camundongos transgênicos e primers de oligonucleotídeos para genotipar esses camundongos.
   1. Breed um camundongo de 3 a 6 meses expressando uma cópia do alelo Cre-driver transgênico/knock-in apropriado e zero cópias do alelo GCaMP3/6 condicional com um segundo camundongo da mesma idade expressando uma ou duas cópias do alelo GCaMP3/6 condicional e zero cópias do alelo Cre-driver.
   2. Geneifique os filhotes e marque aqueles com alelos Cre e GCaMP3 / 6 condicionais - eles serão doravante chamados de camundongos transgênicos duplos (por exemplo, Myf5-Cre, GCaMP3 condicional).
      Nota: Dessa forma, todos os dados serão derivados de camundongos que expressam uma cópia dos alelos Cre e GCaMP3/6 condicional. Isso é particularmente importante ao adicionar outros camundongos mutantes (por exemplo, nocautes) a esses cruzamentos.
2. Quando os camundongos duplamente transgênicos tiverem a idade apropriada (por exemplo, dia 0 ou 5 pós-natal [P0 ou P5] ou adulto), eutanasiar os camundongos decapitando-os com uma tesoura (para camundongos menores que P10) ou colocando-os em uma câmara de inalação de isoflurano. Quando eles não respondem mais a beliscar a cauda com um par de fórceps, eles estão prontos para o sacrifício.
3. Sacrifique o animal por decapitação com uma tesoura.
4. Corte transversal em todo o animal logo abaixo do fígado e logo acima do coração e pulmões com tesoura de iridectomia.
5. Disseque o fígado, o coração e os pulmões, tomando cuidado para manter um comprimento do nervo frênico suficientemente longo para ser puxado para um eletrodo de sucção (ou seja, 1 - 2 cm).
   Nota: O nervo frênico esquerdo pode ser identificado como um pedaço branco de tecido que entra na porção medial do diafragma esquerdo. Não deve ser cortado ao remover os pulmões. O nervo frênico direito corre dentro de um pedaço de fáscia que também contém a veia cava superior e é mais fino e branco que a veia cava. Juntos, ambos penetram no diafragma medial direito.
6. Remova ainda mais a caixa torácica e a coluna vertebral, exceto a crista fina ao redor do diafragma.
7. Coloque o diafragma e a amostra do nervo frênico em um tubo de microcentrífuga com solução de Krebs-Ringer com 1 μg/mL 594-αBTX por 10 min no escuro.
   Nota: Esta concentração de 594-αBTX marca os receptores de acetilcolina (AChRs) sem bloquear sua função (observação pessoal).

2. Estimulação e Registro dos Potenciais de Ação Muscular

1. Usando pinos minucianos, imobilize o diafragma prendendo-o em um prato de 6 cm revestido com gel dielétrico de silicone e preenchido com ~ 8 mL de solução de Krebs-Ringer oxigenada e coloque-o no microscópio stage. Perfundir o diafragma com mais solução de Krebs-Ringer (8 mL/min) por 30 min.
   Nota: Isso enxagua o 594-αBTX não ligado, bem como equilibra o tecido após a dissecção.
2. Faça um eletrodo de sucção de acordo com os métodos estabelecidos.
   1. Com ampliação de 4X, usando um micromanipulador, mova o eletrodo de sucção sobre o nervo frênico esquerdo e aplique a sucção puxando o cilindro de uma seringa de 5 mL conectada ao tubo conectado ao eletrodo de sucção.
      Nota: Quando puxado com sucesso para o eletrodo de sucção, o nervo frênico fica tenso. Ligue o estimulador e estimule o nervo frênico girando o interruptor manual 1x.
   2. Certifique-se de que o diafragma se contraia em resposta à estimulação de 1 Hz, examinando-o visualmente com iluminação de campo claro. Caso contrário, ajuste a voltagem girando o botão de voltagem incrementalmente para obter um pulso supramáximo, que pode ser verificado por um exame visual da contração muscular. Se ainda não estiver visível, sopre o nervo com a seringa e tente puxá-lo novamente aplicando sucção.
3. Desligue a perfusão e adicione o inibidor de miosina específico do músculo BHC6 ou o antagonista do canal de sódio dependente de voltagem μ-conotoxina8 a uma concentração final de 100 μM.
   1. Para fazer 100 μM BHC, pipetar 4 μL de estoque de 200 mM em DMSO e pré-diluí-lo em 1 mL de solução de Krebs-Ringer.
   2. Remova 1 mL de solução de Krebs-Ringer do prato.
   3. Adicione o BHC pré-diluído ao prato.
      Nota: Esta pré-diluição ajuda a prevenir a indução por DMSO não diluído de uma resposta fluorescente não transitória em células que expressam GCaMP3.
   4. Aguarde 30 min e, em seguida, ligue a perfusão da solução fresca de Krebs-Ringer por mais 20 a 30 min.
4. Prepare o eletrodo de gravação.
   1. Usando luvas, coloque um vidro filamentado de borossilicato com um diâmetro externo (OD) de 1 mm e um diâmetro interno (ID) de 0.4 mm em um extrator de micropipeta, aperte os mostradores para prendê-lo na posição e feche a porta do extrator.
   2. Usando um extrator P-97, programe as seguintes configurações: calor a 900, tração a 120, velocidade a 75, tempo a 250, pressão a 500 e sem loops adicionais.
      Nota: A resistência (R) é medida usando controles de software do amplificador: o software de aquisição de dados confirma a resistência resolvendo a fórmula V = IR. O controlador de software passa uma corrente conhecida (I) (normalmente 1 nA) através do eletrodo e mede a mudança na tensão (V), permitindo-nos resolver R.
   3. Para diafragmas embrionários, certifique-se de que a resistência esteja próxima de 60 MΩ e, para diafragmas mais antigos, 10 - 20 MΩ. Carregue o eletrodo de gravação com cloreto de Posatium 3 M (KCl).
5. Com ampliação de 10X, abaixe o eletrodo no músculo, usando um segundo micromanipulador no lado oposto do estágio como eletrodo estimulante.
6. Usando o software de aquisição de dados eletrofisiológicos, espere até que o potencial da membrana em repouso mude de 0 a -65 mV ou menos.
7. Estimule a 1 Hz e verifique a presença de um potencial de ação muscular verificando se há um grande potencial que exiba um overshoot modesto (potencial que sobe acima de 0 mV quando começa em -65 mV ou menos). Não confunda um artefato de estimulação com um potencial de ação.
   Nota: Os potenciais são significativamente mais longos em duração (~ 5 ms) do que os artefatos de estimulação.

3. Imagem da fluorescência da amostra

1. Com ampliação de 20X, localize a banda da placa terminal no centro do músculo procurando por junções neuromusculares marcadas com 594-αBTX ou NMJs sob excitação de luz verde/amarela (550 nm). Mude para a excitação da luz azul (470 nm) para a imagem Ca²⁺ respostas no músculo, neurônio motor ou células de Schwann.
2. Se desejar, configure o divisor de imagem com filtros passa-banda e um filtro dicróico de borda única para imagens de comprimento de onda duplo.
3. Para calcular a fluorescência máxima (Fmax) exibida pelo tecido que expressa GCaMP3 / 6, adicione 12 μL de cloreto de potássio 3 M (KCl) às preparações do diafragma.
   1. Realize experimentos com a barra de brilho na barra da tabela de pesquisa definida para 110% do nível no qual o tecido que expressa GCaMP3/6 exibe saturação com ampliação de 20X sem binning em resposta ao KCl.
4. Grave a 20 quadros por segundo para não perder nenhum evento rápido.
5. Estimule com 1 - 45 s de 20 - 40 Hz de estimulação nervosa fornecendo um trem de impulsos usando o eletrodo de sucção ou adicione agonistas farmacológicos por aplicação de banho ou por perfusão e colete Ca style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>²⁺ respostas em um subtipo de célula junto com o sinal estático 594-αBTX NMJ.
   Nota: Se camundongos indicadores de cálcio geneticamente codificados vermelhos ou vermelhos distantes (GECI) ou indicadores de voltagem geneticamente codificados (GEVI) específicos do tecido se tornarem disponíveis para uso no NMJ, eles podem ser usados para coletar dois sinais dinâmicos refletindo dois elementos celulares distintos no NMJ.
6. Quando os experimentos de imagem ou eletrofisiológicos forem concluídos porque os resultados desejados foram alcançados, perfunda a água através das linhas de perfusão e suge a água 2x - 3x através do eletrodo de sucção para garantir que os sais não se acumulem.

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