Imagem de espalhamento Raman estimulado em duas cores do tecido cerebral de camundongos

Resumo

Fonte: Espinoza, R., et al. Imagem de espalhamento Raman estimulado em duas cores em tempo real do cérebro de camundongos para diagnóstico de tecidos. J. Vis. Exp. (2022).

O vídeo demonstra imagens de espalhamento Raman estimulado (SRS) de duas cores de seções de tecido cerebral de camundongos. Dois feixes de laser sincronizados são direcionados para a seção de tecido para excitar vibrações moleculares, resultando em uma mudança de intensidade relativa nos feixes. Lipídios e proteínas no tecido são detectados usando pares de frequência distintos dos feixes de laser. Os sinais resultantes são então atribuídos a cores separadas, criando uma imagem de duas cores que ajuda a identificar as proteínas e lipídios no tecido.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Detecção de sinal SRS

{TAG_17}}

Modulação eletroóptica (EOM)
NOTA: EOM de 20 MHz é usado para modular a amplitude de Stokes. Conforme discutido posteriormente, o EOM é derivado do trem de pulso de laser de 80 MHz, que é necessário para a modulação ortogonal. Outras frequências de modulação podem ser usadas se apenas SRS de cor única ou hiperespectral for realizada. Nesse caso, a sincronização da frequência de modulação com a frequência do laser é desnecessária. Um gerador de frequência com um amplificador de potência de radiofrequência (RF) pode ser usado para acionar o EOM. Como resultado, as etapas 1.1.1-1.1.4 podem ser ignoradas.

1. Coloque um amostrador de feixe no caminho do feixe de Stokes para captar 10% do feixe e enviá-lo para um fotodiodo rápido para detectar o trem de pulso de 80 MHz.
   NOTA: O sinal do fotodiodo é enviado para um divisor de frequência para gerar uma saída TTL de 20 MHz. Essa saída é enviada para um buffer de fanout para replicar a saída em quatro saídas idênticas de 20 MHz. Uma das saídas é usada para acionar o osciloscópio.
2. Pegue uma das saídas do buffer de fanout e filtre-a com um filtro passa-banda para obter uma onda senoidal de 20 MHz. Use um atenuador de RF para ajustar a tensão pico a pico de saída para ~500 mV.
3. Envie a saída resultante para um deslocador de fase, o que permite o ajuste fino da fase de RF com uma fonte de tensão. Envie esta saída para um amplificador de potência de RF e conecte a saída do amplificador ao EOM.
4. Desbloqueie o feixe de Stokes e otimize a profundidade de modulação do EOM1 colocando um fotodiodo no caminho do feixe. Ajuste o volume EOMtage e placa de quarto de onda até que a profundidade de modulação (relação vale-pico) pareça satisfatória.
   NOTA: Na modulação de 20 MHz (1/4 da taxa de repetição do laser), são esperados dois pulsos a cada 50 ns.

Sobreposição temporal
NOTA: A sobreposição temporal da bomba e Stokes é obtida atrasando um dos dois trens de pulso de laser com um retrorrefletor montado em um estágio de atraso (Figura 1 mostra os Stokes sendo atrasados). A sobreposição grosseira é monitorada com o osciloscópio e a sobreposição fina é monitorada pelo sinal SRS. A sobreposição temporal fina também pode ser alcançada com um autocorrelacionador, se disponível.

1. Coloque um fotodiodo após o espelho dicróico para detectar o feixe de laser. Bloqueie o feixe de Stokes primeiro. Aumente o zoom em um dos picos de pulso da bomba no osciloscópio. Coloque um cursor vertical para marcar a posição temporal desse pico com o osciloscópio.
2. Bloqueie o feixe da bomba e desbloqueie o feixe de Stokes. Traduza o estágio de atraso para corresponder temporariamente a posição de pico no osciloscópio à posição marcada na etapa anterior. Veja Figura 2 para uma exibição da sobreposição temporal de duas vigas.
   1. (OPCIONAL) Se a translação do estágio de atraso for insuficiente para corresponder temporariamente aos dois feixes, mova o estágio de atraso para o meio de sua faixa de movimento.
   2. Calcule a distância de atraso necessária para combinar os dois feixes tomando a diferença temporal entre os dois feixes e multiplicando a diferença pela velocidade da luz para encontrar a quantidade de distância necessária para combinar os dois feixes temporariamente.
   3. Alongue o caminho do feixe do feixe mais rápido ou encurte o caminho do feixe do feixe mais lento para corresponder aproximadamente ao atraso temporal de acordo.
3. Prepare uma amostra de lâmina de microscópio com dimetilsulfóxido (DMSO) e fita dupla-face como espaçador para manter a amostra entre a lâmina e uma lamínula.
4. Coloque a amostra no microscópio com o lado da lamínula voltado para a objetiva do microscópio. Mude o microscópio para iluminação de campo claro e observe a amostra da ocular. Encontre o foco da amostra encontrando primeiro o foco na camada superior e inferior das bolhas de ar na interface da fita de vidro e, em seguida, mova o foco para ficar entre as duas camadas de fita.
   NOTA: Certifique-se de que os feixes de laser estejam bloqueados antes de olhar para a ocular.
5. Defina a saída do feixe sintonizável para 798 nm. Com base na taxa de transferência óptica do condensador, ajuste a potência óptica para ~ 40 mW cada para a bomba e os feixes de Stokes no foco da objetiva.
6. Abra ScanImage no MATLAB (ou outro software de varredura que controle o microscópio) e clique no botão rotulado FOCO para iniciar a digitalização.
   NOTA: Os feixes de laser serão varridos por varredura através do sample para gerar uma imagem. A saída de sinal de baixa frequência do fotodiodo (<100 kHz) é enviada diretamente para o canal 1 da placa de aquisição de dados (conhecido como canal DC). A saída de alta frequência (>100 kHz) do fotodiodo é enviada para o amplificador de bloqueio e a saída X do sinal do amplificador de bloqueio é enviada para o canal 2 da placa de aquisição de dados (conhecido como canal CA).
7. Ajuste o espelho de direção antes do scanner galvo para centralizar o sinal DC no visor do canal 1. Mova o atraso motorizado stage e observe atentamente a saída de bloqueio mostrada no visor do canal 2 (ou seja, canal CA).
   NOTA: Quando a bomba e Stokes coincidirem no tempo, um sinal aparecerá no canal CA. É útil ajustar a escala de cores do canal CA para exibir a pequena mudança de intensidade.
8. Maximize a intensidade do sinal CA ajustando com precisão o atraso de tempo. Ajuste o espelho dicróico para centralizar o sinal SRS no canal CA (mantendo o canal CC centralizado). Ajuste a fase do amplificador de bloqueio para maximizar o sinal. Veja Figura 3 para um sinal satisfatório.

3. Otimização da resolução espectral

{TAG_231}}NOTA:{TAG_236}} A bomba e os feixes de Stokes que atingem a amostra devem ter a mesma quantidade de dispersão de atraso de grupo (GDD) para maximizar a resolução espectral. A dispersão depende muito da configuração experimental. A configuração experimental descrita aqui utiliza pulsos de femtossegundo a 1.040 nm e 800 nm como Stokes e bomba, respectivamente. As hastes de vidro de sílex denso (H-ZF52A) são usadas como meio de alongamento de pulso.

1. Insira 48 cm de uma haste de vidro altamente dispersiva (H-ZF52A ou vidro de sílex denso equivalente) no caminho do feixe de 800 nm. Estime o GDD usando Eq (1):

   

   NOTA: O GVD de vários materiais de vidro em diferentes comprimentos de onda pode ser encontrado no recurso de banco de dados de índice de refração. Por exemplo, o H-ZF52A tem um GVD de 220,40 fs²/mm a 800 nm. O GDD total é 105792 fs².

2. Calcule quantos cm da haste de vidro dispersivo são necessários para adicionar ao caminho do feixe de 1,040 nm para corresponder ao GDD da bomba. Insira o comprimento apropriado das hastes de vidro dispersivo no caminho do feixe de 1,040 nm para corresponder aproximadamente ao GDD do feixe de 800 nm. Observe que a adição de hastes de vidro alterará a sobreposição temporal das duas vigas, e o ajuste do atraso pode ser necessário.
3. Calibração da resolução espectral
   1. Faça uma amostra de lâmina de microscópio com DMSO. Coloque a lâmina no microscópio e verifique a potência dos feixes que saem do condensador do microscópio. Ajuste a potência de acordo para ter ~ 40 mW cada no sample foco.
   2. Abra ScanImage do MATLAB. Encontre o sinal SRS máximo varrendo o estágio de atraso, que corresponde ao pico Raman de 2.913 cm^-1 pico Raman do DMSO. Estime a posição do estágio com base na posição anterior do estágio com o aumento do comprimento do caminho óptico devido à inserção de hastes. Realinhe a sobreposição espacial do feixe devido ao pequeno desvio do feixe quando as hastes de vidro são adicionadas.
   3. Salve uma varredura SRS hiperespectral tirando sequencialmente uma série de imagens SRS enquanto move a platina motorizada.
      NOTA: O intervalo de varredura de atraso cobre dois picos Raman, correspondendo aos picos Raman de 2.913 cm^-1 e 2.994 cm^-1 Picos Raman do DMSO, respectivamente. Essas duas transições são observadas ao utilizar uma bomba de 800 nm e um laser Stokes de 1,040 nm.
   4. Plote os espectros SRS da solução DMSO usando ImageJ ou MATLAB. Ajuste o pico DMSO grande de 2.913 cm^-1 a uma função gaussiana ou lorentziana no MATLAB para calcular a largura total na metade do máximo (FWHM) do pico.
      NOTA: Os resultados representativos são mostrados em Figura 4. Se apenas um pico amplo estiver presente, isso significa que a resolução espectral é muito baixa para distinguir os dois picos e mais hastes de vidro são necessárias, ou o alcance escaneado era muito pequeno para detectar o segundo pico. Normalmente, uma resolução espectral aceitável DMSO é ~ 20-25 cm ^-1 quando um comprimento de haste de vidro de >60 cm é usado. Uma resolução mais baixa é frequentemente usada para imagens de tecidos para trocar por sinais mais altos com pulsos mais curtos.
4. (OPCIONAL) Use um autocorrelacionador ou um FROG (Frequency-Resolved Optical Gating) para determinar a duração do pulso de cada braço para calcular exatamente a quantidade de GDD e o comprimento das hastes necessárias para combinar o GDD entre a bomba e os Stokes.
5. Repita as etapas 3.3.2-3.3.4 para diferentes comprimentos de haste no feixe Stokes para encontrar a resolução espectral ideal, o que significa que a melhor correspondência GDD foi encontrada experimentalmente. Use vários conjuntos de hastes de vidro com comprimentos diferentes para obter a resolução espectral ideal.

4. Caracterização sinal-ruído (SNR)

1. Certifique-se de que a etapa 4.2 seja executada após o alinhamento espacial e temporal completo.
2. Adquira uma imagem SRS correspondente ao pico Raman de 2.913 cm^-1 pico Raman do DMSO. Abra a imagem no ImageJ e selecione uma pequena área no centro do quadro. Use a função meça para calcular a média e o desvio padrão dos valores na área selecionada.

3. Divida o valor médio da área selecionada pelo desvio padrão para encontrar o valor SNR, como em Eq (2).

   

   NOTA: Um bom SNR para o sistema (com uma constante de tempo de bloqueio de 4 μs) usando DMSO a 40 mw/40 mw no foco para ambos os braços é >800. Concentrações mais baixas de DMSO ou menor potência podem ser usadas para uma estimativa mais precisa do SNR se a placa de aquisição de dados tiver uma profundidade de bits limitada.

4. Se o SNR for muito baixo, realinhe os pulsos de laser para otimizar a sobreposição espacial, a sobreposição temporal, a correspondência de tamanho/colimação do feixe e/ou a correspondência de dispersão. Para uma objetiva com um colar de correção de aberração, otimize o sinal ajustando o colar de correção.

5. Calibração do eixo de frequência

NOTA: Esta etapa é executada para relacionar a posição do estágio de atraso com a transição Raman digitalizada. A seleção cuidadosa de solventes é necessária para gerar uma "Régua Raman" apropriada. O DMSO é um solvente eficaz para ligações CH, pois possui dois picos Raman acentuados a 2.913 cm^-1 e 2.994 cm^-1{TAG_484}}.

1. Salve uma varredura hiperespectral com o intervalo de estágio de atraso cobrindo os picos Raman de 2.913 cm^-1 e 2.994 cm^-1 picos Raman do DMSO. Salve as posições do palco correspondentes ao conjunto de dados hiperespectral.
   NOTA: O pico máximo global do espectro corresponde ao deslocamento Raman DMSO 2.913 cm^-1} e o segundo pico máximo corresponde ao deslocamento Raman DMSO 2.994 cm^-1.
2. Execute a regressão linear para as posições do palco e deslocamentos Raman em 2.913 cm^-1 e 2.994 cm^-1{TAG_542}}. Usando a equação de regressão linear relacionando a posição do estágio com o deslocamento Raman, converta as posições de atraso para as frequências Raman correspondentes.

6. Modulação ortogonal e imagem em duas cores

NOTA: A etapa de modulação ortogonal só é necessária quando a imagem em duas cores em tempo real é necessária. O esquema deste esquema é mostrado em Figura 5{TAG_567}}. A modulação ortogonal usa um par de EOMs acionados a um quarto da frequência do laser (20 MHz para um laser de 80 MHz) com uma mudança de fase de 90° entre os dois. Esta etapa de modulação ortogonal pode ser ignorada para imagens SRS de cor única ou imagens SRS hiperespectrais.

1. Modulação EOM1
   1. Instale um divisor de feixe polarizador (PBS2), uma placa de quarto de onda (QWP2) e um segundo EOM (EOM2) no caminho do feixe de Stokes após o primeiro EOM. Desconecte a entrada de sinal para EOM2. Conecte a entrada de sinal ao EOM1 e ligue-a.
   2. Modular o feixe de Stokes (fixado em 1.040 nm) a 20 MHz (f₀{TAG_592}}/4) enviando o feixe através do primeiro EOM. Ajuste a inclinação e a posição do EOM1 para garantir que o feixe esteja batendo em linha reta e centralizado através do cristal EOM.
   3. Monitore a profundidade de modulação observando ambas as polarizações saindo de PBS1 com dois fotodiodos e exibindo a modulação em um osciloscópio.
   4. Ajuste o QWP1, EOM1 voltage e fase da entrada de 20 MHz (usando um deslocador de fase) para otimizar a profundidade de modulação do feixe transmitido para ficar próximo a 100%. Veja Figura 2B para uma ilustração de boa profundidade de modulação.
2. Modulação EOM2
   1. Desconecte o EOM1 e conecte o EOM2.
   2. Envie o alto voltage saída do segundo amplificador a 20 MHz para EOM2. Ajuste a inclinação e a posição do EOM2 para garantir que o feixe esteja batendo em linha reta e centralizado através do cristal EOM.
   3. Mais uma vez, monitore a profundidade de modulação observando ambas as polarizações que saem do PBS2 com um osciloscópio. Ajuste a tensão QWP2, EOM2 e o deslocador de fase conforme necessário para obter uma modulação próxima a 100% para ambas as polarizações.
   4. Certifique-se de que a modulação do trem de pulso tenha uma mudança de fase de 90° em relação à primeira modulação.
      NOTA: Se os dois trens de pulso da bomba não forem ortogonais a 90°, a diafonia entre os dois canais será um problema.
   5. Teste a ortogonalidade da modulação ligando e conectando EOM1 e EOM2. Monitore ambas as polarizações sendo divididas por PBS2 com um osciloscópio. Reotimize EOM1 e EOM2 individualmente se o trem de pulso após o segundo PBS não se assemelhar a Figura 2C.
   6. Instale um cristal de quartzo birrefringente (BRC) de 20 mm e uma placa de meia onda (HWP) a jusante do EOM2. Conecte os dois EOMs ao mesmo tempo e monitore o trem de pulso de forma que ele se assemelhe a Figura 2D.
      NOTA: Para o chirp usado neste experimento, o BRC de 20 mm induz um atraso de tempo que corresponde a um deslocamento Raman de 80 cm^-1. Um comprimento BRC diferente pode ser necessário se um chirp diferente for usado.
3. Calibração
   1. Calibre o sistema usando DMSO detectando sinais da saída dos canais X e Y do amplificador de bloqueio (enviados para os canais 2 e 3 da placa de aquisição de dados).
   2. Verifique se os sinais gerados pelo pico de 2.913 cm^-1 da polarização mais rápida e da polarização mais lenta estão próximos de 90° fora de fase no amplificador de bloqueio. Se este não for o caso, ajuste o alinhamento EOM até que os dois sinais estejam próximos de 90° fora de fase.
   3. Quando a calibração estiver concluída, encontre a posição de atraso que sonda a transição da proteína a 2.930 cm^-1 para um dos feixes ortogonais. Certifique-se de que a outra polarização sonda a transição lipídica de 2.850 cm^-1.

7. Imagem SRS de modo epi

{TAG_749}}NOTA: No esquema de imagem do modo de transmissão, a objetiva focaliza o laser na amostra e, em seguida, uma lente condensadora direciona o feixe transmitido para um fotodiodo para detecção de travamento. No esquema de imagem de modo epi, a luz retroespalhada e despolarizada pela amostra é recolhida pela objetiva de focagem e isolada usando um divisor de feixe polarizador. Os fótons isolados e retroespalhados são enviados para um fotodiodo através de um par de lentes de relé para detecção de bloqueio. Figura 6 descreve o esquema de imagem em modo epi.

1. Instale um HWP antes que o feixe entre no microscópio para alterar a polarização do feixe que entra no microscópio. Coloque um PBS acima da objetiva para permitir que o feixe refletido de fundo despolarizado alcance o detector.
2. Use um par de lentes consistindo de uma lente acromática de 75 mm e uma lente asférica de 30 mm para retransmitir os fótons retroespalhados da abertura traseira da objetiva para o fotodetector. Monte o detector para coletar a luz retroespalhada direcionada pelo PBS. Instale um filtro para impedir que o feixe modulado entre no detector.
3. Coloque a amostra de tecido sob a objetiva. Como o condensador é desnecessário para imagens em modo epi, remova-o se for necessário mais espaço.
4. Imagem
   1. Bloqueie o feixe com um obturador; Ilumine lateralmente uma fonte de luz branca sobre a amostra; e use o campo claro para encontrar o foco objetivo.
   2. Desbloqueie ambos os feixes e use as posições de atraso pré-calibradas para adquirir imagens SRS de lipídios e proteínas do tecido das duas saídas do amplificador de bloqueio.
   3. Ajuste o ganho de bloqueio e o fator de bloqueio de pixels para adquirir imagens de boa qualidade.

8. Coloração de cor falsa

1. Abra a pilha de imagens com ImageJ.
2. Retire as duas imagens que correspondem às espécies de lipídios (2.850 cm^-1) e proteína (2.930 cm^-1) clicando com o botão direito do mouse na imagem e clicando em Duplicar.
3. Renomeie a imagem lipídica para lipídios e a imagem da proteína para proteínas.
4. Vá para Processo | Calculadora de Imagens e execute proteínas subtrair }lipídios{TAG_888}}.
5. Combine as imagens indo para Image | Cor | Mesclar canais, definindo lipídios } para }verde }e proteínas para blue. Abra a ferramenta image channels} (Image | Cor | Ferramenta Canais) e ajuste o brilho e o contraste (Imagem | Ajustar | Brilho/Contraste).
6. Ajuste o brilho e o contraste de cada canal usando a ferramenta }canais . Para o canal lipídico, ajuste o contraste até que as características celulares pareçam escuras. Para o canal de proteína, ajuste o contraste até que as características celulares apareçam em azul. Converta a imagem verde/azul do canal mesclado em uma imagem RGB acessando Image | Tipo | Cor RGB. Exportar esta imagem por Arquivo | Salvar como | Tiff.
   NOTA: Para coloração falsa de H&E, o esquema de cores mostra citoplasma rosa, enquanto os núcleos são azul-púrpura escuro.
7. Baixe o script HE.m MATLAB do recurso de script de coloração H&E falso na Tabela de Materiais.
8. Execute o script HE.m no MATLAB. Selecione a imagem RGB exportada da etapa anterior para gerar uma imagem artificialmente manchada com H&E.
9. (OPCIONAL) Normalize a intensidade da imagem para imagens de campo de visão grande porque a imagem parece mais escura na periferia do que no centro.
   1. Para executar a normalização de campo das imagens, calcule a média do maior número possível de imagens. Em seguida, remova os recursos de intensidade com ImageJ (Process | Filtros | Desfoque Gaussiano | Raio=50).
   2. Meça a intensidade máxima da imagem desfocada (Ctrl+M{TAG_1020}}). Divida a imagem desfocada pela intensidade máxima (Processo | Matemática | Dividir). Divida a imagem SRS bruta pela imagem desfocada (Processo | Imagem | Calculadora).

Resultados

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
100 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-100-B	Broadband, 650 - 1.050 nm, distância focal da lente acromática, 100 mm
20 MHz bandpass filter	Minicircuits	BBP-21.4+	Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-200-B	Broadband, 650 - 1.050 nm, distância focal da lente acromática, 200 mm
Achromatic Half Waveplate	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate	Union Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	Broadband quarter waveplate
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
Espelho dicróico	THORLABS	DMSP1000	Outras dicróicas com comprimento de onda central em torno de 1.000 nm podem ser usadas.
DMSO (dimetilsulfóxido)	Sigma Aldrich	472301	Solvente para calibração do deslocamento Raman. Outros solventes com picos Raman conhecidos podem ser usados.
Electrooptic Amplitude Modulator	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Dois EOMs são necessários para modulação ortogonal e imagem de canal duplo. A versão ressonante é recomendada para que uma tensão de acionamento mais baixa possa ser usada.
False H&E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer e Line Driver, para gerar a frequência de condução EOM e a referência ao lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Detector Si, 1 ns Tempo de subida
Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL Freq. Divisor (f/2, f/4, f/8, f/16), para gerando 20MHz a partir da saída do laser.
Hastes de vidro altamente dispersivas<	CYLROD01	Lente de haste H-ZF52A de alta dispersão 120 mm, haste SF11 lente 100 mm
Insight DS+	Newport		Sistema de laser capaz de emitir dois lasers pulsados sincronizados (um feixe fixo a 1.040 nm e um feixe sintonizável, variando de 680-1.300 nm) com uma taxa de repetição de 80 MHz.
Lock-in Amplifier	Liquid Instruments	Moku Lab	Amplificador de bloqueio para extrair o sinal SRS do fotodiodo. Um instrumento Zurich HF2LI ou instrumento semelhante também pode ser usado.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	Espelho dielétrico de banda larga, 750 - 1.100 nm. Espelhos prateados também podem ser usados.
Motorized Delay Stage	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Estágio de atraso para controle fino da sobreposição temporal da bomba e dos lasers Stokes. Qualquer outro estágio motorizado deve funcionar.
Oil Immersion Condensor	Nikon	CSC1003	1.4 NA. Outros condensadores com NA>1.2 podem ser usados.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054	Qualquer outro osciloscópio com largura de banda de 400 MHz ou superior deve funcionar.
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	Para mudar a fase da frequência de modulação
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Diodo PIN de silício com grande área (10 x 10 cm2). Outros diodos com grande área e baixa capacitância podem ser usados.
Polarizing Beam Splitter	Union Optic	PBS9025-620-1000	Polarizador de banda larga
Refactive Index Database			refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR Right Angle Prism. Outros prismas ou retrorrefletores podem ser usados.
RF Power Amplifier	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	Usamos um espelho de 5 mm com revestimento prateado
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Software de controle de microscópio de varredura a laser
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25,0 mm, comprimento de onda de corte: 1.000 nm. Para uma supressão eficiente dos Stokes, dois filtros podem ser necessários.
Upright Microscope	Nikon	Eclipse FN1	Qualquer outra estrutura de microscópio pode ser usada. Se um microscópio de varredura a laser estiver disponível, ele pode ser usado diretamente. Caso contrário, um scanner galvo e uma lente de varredura precisavam ser adicionados ao microscópio.
Water Immersion Objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	O multifotônico 25X Objective tem um NA de 1,05. Outros objetivos semelhantes podem ser usados.

td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Union Optic