Microscopia de dois fótons de astrócitos e neurônios excitatórios em um tecido hipocampal de camundongo limpo

Resumo

Fonte: Refaeli, R., et al., Investigação da interação espacial entre astrócitos e neurônios em cérebros limpos. J. Vis. Exp. (2022)

O vídeo demonstra a preparação de uma câmara e a neuroimagem do tecido do hipocampo de camundongo limpo usando microscopia de dois fótons para visualizar as interações espaciais entre astrócitos marcados com fluorescência e neurônios excitatórios.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Preparação da câmara

OBSERVAÇÃO: Cada amostra requer uma lâmina com uma câmara de imagem na qual a amostra será colocada.

1. Coloque a amostra no meio do slide.
2. Usando uma pistola de cola quente, crie paredes nas bordas da lâmina, quase tão altas quanto o tecido. Certifique-se de deixar um pequeno espaço (aproximadamente 5 mm) em um dos cantos (Figura 1A, B).
3. Aplique 1-2 gotas da solução correspondente ao índice de refração ou RIMS na amostra para manter a superfície superior úmida e evitar a formação de bolhas entre a lamínula e o tecido.
4. Imediatamente após a aplicação das gotas RIMS (solução de correspondência de índice de refração), adicione a última camada de cola quente às paredes (para que atinjam a altura do cérebro/fatia) e progrida imediatamente (enquanto a cola quente ainda é líquida) para a etapa 1.5.
5. Sele a parte superior com uma lamínula, colocando-a o mais uniformemente possível na parte superior da camada de cola quente ainda quente (Figura 1C).
6. Encha a câmara com as bordas através da lacuna deixada nas paredes de cola quente (Figura 1D, E).
7. Feche a lacuna com cola quente. Não deixe ar dentro (Figura 1F).
8. Se as paredes de cola quente se estenderem além das bordas do slide, corte as bordas estendidas (Figura 1G).
9. Se a objetiva usada para a imagem estiver imersa, adicione mais 2-3 mm de cola nas paredes acima da lamínula para que a solução de imersão dure mais (Figura 1H).

Resultados

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
AAV1-GFAP::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		Vetor viral usado para detectar astrócitos
AAV5-CaMKII::eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		Vetor viral usado para detectar neurônios
AAV5-CaMKII::H2B-eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		Vetor viral usado para detectar núcleos neuronais
AAV5-CaMKII::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		Vetor viral usado para detectar neurônios
Imaris software	Bitplane, UK		Um software que permite a análise 3D de imagens
RapiClear	SunJin lab	#RC147002
RapiClear CS	SunJin lab	#RCCS002
SyGlass software			Um software que permite a análise 3D de imagens usando realidade virtual
Two Photon microscope	Neurolabware		Ti:laser de safira (Chameleon Discovery TPC, Coherent), tubos fotomultiplicadores GaAsP (Hamamatsu, H10770-40), filtro passa-banda (Semrock), objetiva de imersão em água 16x (Nikon, 0.8 NA)
VA-044 Initiator	Wako	#011-19365