$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Análises morfológicas de neurônios de grânulos cerebelares ou CGNs - reconstrução tridimensional (3D) e área de superfície e volume celular
- Imagem de CGNs eletroporados únicos em um microscópio confocal a objetiva de 63x com zoom de 2x, tirando imagens de pilha z a 0,5 μm por pilha. Imagem de uma célula por janela de imagem para permitir fácil análise e reconstrução de imagens.
- Instale o plug-in Simple Neurite Tracer para FIJI usando o seguinte link (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_Instructions) para rastrear de forma fácil e eficiente a estrutura de CGNs eletroporados no espaço tridimensional (3D).
NOTA: Há uma versão atualizada do plug-in (https://imagej.net/SNT).
- Analise o comprimento do neurite e a formação da garra dendrítica de maneira cega usando um Rastreador de neurite simples. Carregue imagens de pilha z de canal único de CGNs eletroporados em FIJI e clique em Plugins | Segmentação | Rastreador de neurite simples (Figura 1D).
- Acesse o menu suspenso e selecione Criar novo visualizador em 3D (Figura 1D).
- Role até a base de um dendrito, onde ele se conecta ao soma celular, e inicie um caminho clicando na junção. Trace manualmente o caminho clicando nas seções onde o sinal de preenchimento da célula é mais brilhante, pressionando [y] para manter o rastreamento. Trace até o final do dendrito se ele não contiver uma garra ou até a base da garra e confirme o caminho pressionando [f] (Figura 2D).
- Em seguida, trace a garra iniciando um caminho na base da estrutura e traçando até o final da neurite mais longa. Rastreie ramificações secundárias e terciárias mantendo pressionada a tecla [ctrl] no Windows ou [alt] em um Mac OS e clicando no caminho. Confirme o caminho pressionando [f].
- Observe que as medições dos traços são visíveis em uma janela separada; Some todas as medidas dos ramos da garra (primária, secundária, terciária) para obter o comprimento total de cada garra.
- Para analisar a área de superfície e o volume celular de CGNs eletroporados, baixe o software de análise de células Imaris (https://imaris.oxinst.com/).
NOTA: FIJI também pode ser usado para reconstruir células em 3D a partir de imagens z-stack usando plug-ins prontamente disponíveis e gratuitos. Além disso, o Simple Neurite Tracer possui um recurso de renderização volumétrica, mas o Imaris foi usado pelos motivos descritos abaixo.
- Carregue uma imagem z-stack de um CGN eletroporado no Imaris. Acesse o kit de ferramentas de reconstrução 3D pressionando Avançar.
- Para reconstruir o CGN, pressione Superfícies e selecione uma região de interesse que englobe toda a célula dentro da janela de imagem. Quando terminar, pressione a seta azul para frente no canto inferior direito em Criar.
- Se a imagem contiver vários canais para sinais diferentes, selecione o canal que contém o CGN eletroporado e pressione a seta azul para frente.
- Usando a barra lateral, defina um limite desejado que se ajuste com mais precisão ao sinal da célula eletroporada. Aumente o zoom para mais perto da superfície da célula para determinar com precisão o limite. Quando terminar, pressione a seta verde dupla para reconstruir a célula e obter a área da superfície e o tamanho do volume dos metadados.
