Imagem simultânea da dinâmica microglial e atividade neuronal em um camundongo acordado

Resumo

Fonte: Maruoka, H., et. al. Imagem simultânea da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados. J. Vis. Exp.Exp.. (2022)

Este vídeo mostra um procedimento de microscopia de dois fótons para imagem da atividade neuronal e da dinâmica microglial em um camundongo acordado durante a estimulação visual, destacando transientes de cálcio e interações celulares.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

Imagem in vivo de dois fótons da microglia e dinâmica neuronal do cálcio

1. Habituação de camundongos ao aparelho microscópico

1. Três semanas após a cirurgia, induzir anestesia no camundongo com isoflurano a 3% e colocar o camundongo sob a lente objetiva de 25x de um microscópio de dois fótons usando um instrumento estereotáxico feito sob medida (Figura 1C). Para a configuração, o mouse é colocado no topo de uma esteira e pode funcionar livremente.
2. Aproximadamente 10 minutos depois, remova o mouse do microscópio stage e retorne-o à gaiola inicial. Repita a habituação pelo menos 3 vezes a cada dia alternado antes da aquisição da imagem de dois fótons.

2. Aquisição de imagem de dois fótons

NOTA: Recomendamos realizar a aquisição da imagem mais de 4 semanas após a cirurgia, pois a ativação microglial retorna gradualmente ao nível basal.

1. Induza a anestesia no camundongo com isoflurano a 3% e coloque o camundongo sob a lente objetiva do microscópio de dois fótons usando um instrumento estereotáxico feito sob medida.
2. Instale o dispositivo de sombreamento personalizado (Figura 1A e Figura 1B) e um monitor LCD para estimulação visual conforme descrito abaixo (Figura 1D).
   1. Posicione a lente para focar na superfície do cérebro e, em seguida, defina essa posição da lente como a posição Z original. Mantenha as coordenadas x-y constantes e eleve a lente objetiva; Remova o mouse e o instrumento estereotáxico da lente objetiva e da esteira.
   2. Prenda um dispositivo de sombreamento na parte superior da placa principal usando silicone, que é escurecido pela mistura com pó de carvão, e certifique-se de que o espaço entre a placa principal e o dispositivo de sombreamento esteja bem vedado.
   3. Encha o dispositivo de sombreamento com água destilada e, em seguida, fixe o mouse e a moldura estereotáxica novamente sob a objetiva e na esteira. Redefina cuidadosamente o plano focal na superfície do cérebro, verificando a profundidade da lente objetiva.
      NOTA: Para evitar o risco de danificar a lente objetiva, defina primeiro as coordenadas xyz e, em seguida, aplique o dispositivo de sombreamento da lente objetiva. Também é razoável instalar a tampa primeiro e depois ajustar as coordenadas, mas é necessário um manuseio cauteloso para esta opção.
   4. Cubra a lente objetiva com folha de alumínio preta para evitar a contaminação luminosa do monitor LCD usado para estimulação visual através da lente objetiva (Figura 1D). Defina um monitor LCD de 10 polegadas a 12,5 cm na frente dos olhos do mouse para apresentar estímulos visuais (Figura 1D).
3. Configure os filtros de coleta de emissão de fluorescência para fluorescência EGFP (filtro de emissão de 525/50 nm) e fluorescência R-CaMP (filtro de emissão de 593/46 nm) e o comprimento de onda de excitação para 1,000 nm. Adquira imagens com resolução espacial de 0,25 μm/pixel usando uma objetiva de 25x 1,1 NA e PMTs GaAsP.
4. Encontre a região de imagem na qual os neurônios R-CaMP (+) e a micróglia EGFP (+) podem ser visualizados simultaneamente na camada 2/3. Para esta configuração, os dados obtidos em Figura 2 estavam a uma profundidade de 100 μm da superfície pial, usando uma visualização de imagem ao vivo. Mantenha a potência do laser de excitação o mais baixa possível para evitar fotobranqueamento e danos causados pelo aumento da temperatura local na região da imagem.
5. Adquira imagens na taxa de quadros de 30 Hz. Simultaneamente com a aquisição da imagem, apresente um estímulo visual de deriva-grade a 100% de contraste, 1,5 Hz, 0,04 ciclos por grau em 12 direções a 6 orientações de 0° a 150° em passos de 30° para o mouse.
6. Após a aquisição da imagem, remova o mouse da platina do microscópio, retire o dispositivo de sombreamento e o instrumento estereotáxico do mouse e retorne o mouse à sua gaiola inicial.

Resultados

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
monitor LCD de 10 polegadas	EIZO	DuraVision FDX1003	Para apresentar estímulos visuais irritantes
Black folha de alumínio	THORLABS	BKF12
CX3CR1-EGFP mouse	Laboratório Jackson	IMSR_JAX: 005582	CX3CR-1EGFP/+ knock-in/knock-out camundongos expressando EGFP em microglia no cérebro sob o controle do locus Cx3cr1 endógeno
DENT SILICONE-V	Shofu Inc	N/A	Para a anexação de um sombreamento device a uma placa de cabeça
Head-plate<	N/A	Material: SUS304, espessura: 0.5mm
Isoflurano	Pfizer	N/A
Microscópio de excitação multifóton	NIKON	N/A	O nome comercial é "A1MP+"
Objective lens	NIKON	N/A	O nome comercial é "CFI75 apochromat 25xC W".
Psychtoolbox		Software livre	Para apresentar estímulos visuais irritantes
Dispositivo de sombreamento	Customized	N/A
Stereotaxic instrument	Customized	N/A	Para fixar mouses sob o microscópio de dois fótons microscope
Treadmill	Customized	N/A

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