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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
Imagem in vivo de dois fótons da microglia e dinâmica neuronal do cálcio
1. Habituação de camundongos ao aparelho microscópico
- Três semanas após a cirurgia, induzir anestesia no camundongo com isoflurano a 3% e colocar o camundongo sob a lente objetiva de 25x de um microscópio de dois fótons usando um instrumento estereotáxico feito sob medida (Figura 1C). Para a configuração, o mouse é colocado no topo de uma esteira e pode funcionar livremente.
- Aproximadamente 10 minutos depois, remova o mouse do microscópio stage e retorne-o à gaiola inicial. Repita a habituação pelo menos 3 vezes a cada dia alternado antes da aquisição da imagem de dois fótons.
2. Aquisição de imagem de dois fótons
NOTA: Recomendamos realizar a aquisição da imagem mais de 4 semanas após a cirurgia, pois a ativação microglial retorna gradualmente ao nível basal.
- Induza a anestesia no camundongo com isoflurano a 3% e coloque o camundongo sob a lente objetiva do microscópio de dois fótons usando um instrumento estereotáxico feito sob medida.
- Instale o dispositivo de sombreamento personalizado (Figura 1A e Figura 1B) e um monitor LCD para estimulação visual conforme descrito abaixo (Figura 1D).
- Posicione a lente para focar na superfície do cérebro e, em seguida, defina essa posição da lente como a posição Z original. Mantenha as coordenadas x-y constantes e eleve a lente objetiva; Remova o mouse e o instrumento estereotáxico da lente objetiva e da esteira.
- Prenda um dispositivo de sombreamento na parte superior da placa principal usando silicone, que é escurecido pela mistura com pó de carvão, e certifique-se de que o espaço entre a placa principal e o dispositivo de sombreamento esteja bem vedado.
- Encha o dispositivo de sombreamento com água destilada e, em seguida, fixe o mouse e a moldura estereotáxica novamente sob a objetiva e na esteira. Redefina cuidadosamente o plano focal na superfície do cérebro, verificando a profundidade da lente objetiva.
NOTA: Para evitar o risco de danificar a lente objetiva, defina primeiro as coordenadas xyz e, em seguida, aplique o dispositivo de sombreamento da lente objetiva. Também é razoável instalar a tampa primeiro e depois ajustar as coordenadas, mas é necessário um manuseio cauteloso para esta opção. - Cubra a lente objetiva com folha de alumínio preta para evitar a contaminação luminosa do monitor LCD usado para estimulação visual através da lente objetiva (Figura 1D). Defina um monitor LCD de 10 polegadas a 12,5 cm na frente dos olhos do mouse para apresentar estímulos visuais (Figura 1D).
- Configure os filtros de coleta de emissão de fluorescência para fluorescência EGFP (filtro de emissão de 525/50 nm) e fluorescência R-CaMP (filtro de emissão de 593/46 nm) e o comprimento de onda de excitação para 1,000 nm. Adquira imagens com resolução espacial de 0,25 μm/pixel usando uma objetiva de 25x 1,1 NA e PMTs GaAsP.
- Encontre a região de imagem na qual os neurônios R-CaMP (+) e a micróglia EGFP (+) podem ser visualizados simultaneamente na camada 2/3. Para esta configuração, os dados obtidos em Figura 2 estavam a uma profundidade de 100 μm da superfície pial, usando uma visualização de imagem ao vivo. Mantenha a potência do laser de excitação o mais baixa possível para evitar fotobranqueamento e danos causados pelo aumento da temperatura local na região da imagem.
- Adquira imagens na taxa de quadros de 30 Hz. Simultaneamente com a aquisição da imagem, apresente um estímulo visual de deriva-grade a 100% de contraste, 1,5 Hz, 0,04 ciclos por grau em 12 direções a 6 orientações de 0° a 150° em passos de 30° para o mouse.
- Após a aquisição da imagem, remova o mouse da platina do microscópio, retire o dispositivo de sombreamento e o instrumento estereotáxico do mouse e retorne o mouse à sua gaiola inicial.
