Quantificando neurônios recém-gerados no tecido cerebral de ratos usando a técnica do fracionador óptico

Abstract

Fonte: Olesen, M. V., et al. A técnica do fracionador óptico para estimar o número de células em um modelo de rato de terapia eletroconvulsiva. J. Vis. Exp. (2017).

O vídeo demonstra a técnica para quantificar neurônios recém-gerados no tecido cerebral. Fatias de tecido hipocampal contendo neurônios marcados com bromodeoxiuridina (BrdU) foram coradas usando imuno-histoquímica e posteriormente quantificadas em toda a espessura do tecido usando a técnica do fracionador óptico.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Processamento de tecidos

OBSERVAÇÃO: Após a perfusão transcárdica e pós-fixação em paraformaldeído (PFA) a 4% diluído em tampão fosfato 0,2 M durante a noite a 4 °C, os cérebros são transferidos para sacarose a 30% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por três dias a 4 °C. Depois disso, os cérebros são congelados em pó seco

1. Separe os hemisférios direito e esquerdo ao longo da linha média do cérebro usando um bisturi. Em seguida, escolha um ou outro hemisfério aleatoriamente no primeiro cérebro. Depois, alterne sistematicamente entre os hemisférios direito e esquerdo (Figura 1A). Montar o hemisfério amostrado num disco de amostra com o eixo longo perpendicular ao disco utilizando um suporte de montagem.
2. Coloque recipientes numerados de vários pratos para pré-resfriamento no criostato.
3. Monte o disco da amostra no criostato e corte todo o hipocampo (Bregma 1,80 a - 7,04) em seções de 80 μm de espessura no plano coronal (Figura 1B).
   1. Coloque todas as seções amostradas consecutivamente nos recipientes multiprato resfriados para manter as seções em ordem de corte.
   2. Cubra as seções completamente com crioprotetor e mantenha os recipientes a -20 °C até uso posterior.

2. Imunocoloração

OBSERVAÇÃO: Para acompanhar as seções individuais durante todo o procedimento de coloração, coloque as seções amostradas em redes de coloração de 25 poços. Use a cada 5ª seção, dando um número final médio de 12 (8-16) seções por hipocampo para imunocoloração e subsequente contagem de células.

1. Antes de subamostrar cada enésima seção com um início aleatório entre as seções um e n (Figura 1C), transfira os recipientes de -20 °C para a temperatura ambiente (RT).
2. Use um pincel, por exemplo, para transferir as seções em ordem numérica para as redes de coloração de 25 poços colocadas em placas de Petri preenchidas com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   NOTA: A partir deste ponto, manter as secções das redes de coloração colocadas em pratos de vidro correspondentes num agitador orbital (secções 2.3 a 2.9).
3. Transfira as redes de coloração para os pratos de vidro correspondentes e lave as seções duas vezes por 10 min em PBS à temperatura ambiente (RT) antes da incubação em peróxido de hidrogênio a 3% (H₂O₂) diluído em água destilada (dH₂O) por 20 min.
4. Transfira as seções para três soluções diferentes de ácido clorídrico (HCl) (1 M a 0 ° C por 10 min, 2 M a RT por 10 min e 2 M a 37 ° C por 20 min) antes da neutralização em tetraborato de sódio 0,1 M em RT por 20 min.
5. Após 3 × 10 min de incubação em Triton X-100 a 1% diluído em PBS (tampão de lavagem), transfira as seções para tampão de lavagem contendo 10% de soro fetal bovino (solução de bloqueio) por 1 h em RT.
6. Incubar as secções durante 48 h a 4 °C em ratinho-anti-BrdU (5-bromo-2'-desoxiuridina) diluído a 1:100 em solução de bloqueio.
7. Lave as seções 3 × 10 min em tampão de lavagem e incube por 48 h em peroxidase de rabanete diluída 1:10 em tampão de lavagem.
8. Transfira as seções para PBS por 5 × 10 min e depois por 7 min em diaminobenzidina a 0,01% (DAB) diluída em PBS antes de serem transferidas para uma solução DAB semelhante contendo 0,02% H₂O₂ por 10 min no RT.
9. Complete uma série de lavagens (2 × 10 min em PBS e 2 × 10 min em tampão fosfato sem adição de cloreto de sódio) e monte as seções em ordem numérica nas lâminas do microscópio.
10. Seque as seções por aproximadamente 30 min antes de contra-corar com violeta cresila.
11. Coloque as lâminas do microscópio em um suporte de lâminas.
12. Reidrate as seções por 10 min em pratos de coloração de slides contendo dH₂O e, em seguida, transfira os slides para 0,02% de violeta cresil em dH₂O por 15 min.
13. Repita a etapa 2.12 antes que as seções sejam desidratadas três vezes em etanol (96% por 5 min e 99% por 2 × 2 min).
14. Coloque as seções em xileno por 2 × 15 min e cubra as lâminas usando um meio de secagem rápida para montagem.
15. Finalmente, deixe as lâminas com lamínula por aproximadamente 24 horas antes que possam ser usadas para microscopia.

3. Estimativa do número total de neurônios marcados com BrdU usando o fracionador óptico

NOTA: Realize um estudo piloto que inclua alguns animais para determinar os parâmetros de amostragem ideais, como o número de seções a serem analisadas e o número de dissectores ópticos dentro das seções amostradas. Este piloto também fornece um CV preliminar (desvio padrão/média) e a possibilidade de ajustar o CE para obter uma precisão satisfatória das estimativas determinadas pelo investigador (para mais detalhes, veja abaixo). Da mesma forma, uma análise de distribuição z abordará os seguintes pontos: encolhimento do tecido, qualidade da coloração ao longo da seção e distribuição das células no eixo z.

1. Verifique a espessura do tecido nas seções para confirmar se elas são adequadas para o uso do fracionador óptico, por exemplo, espessas o suficiente para a altura do dissecador escolhido, incluindo zonas de proteção (veja abaixo). NOTE: A espessura do tecido é medida em vários locais dentro da região de interesse.
   1. Coloque as lâminas no motorizado
   2. Delineie a área de interesse usando uma objetiva de baixa ampliação (2X ou 4X) antes de mudar para uma objetiva de imersão em óleo de 100X (consulte Figura 2A).
   3. Usando um ponto específico de um quadro de contagem (e.g., em um canto ou adjacente a ele), localize a parte superior da seção movendo-se ao longo do plano focal até que algum recurso de corte apareça em foco. Registre essa posição z como 0 (consulte Figura 2B).
   4. Mova o plano focal para baixo através do tecido até que o mesmo ponto específico do quadro de contagem esteja no último nível z do tecido em foco e marque essa posição. A espessura local do tecido é definida de 0 a este ponto final e pode ser lida no eixo z. Registre a espessura do tecido (consulte Figura 2B).
2. Documente a penetração total da mancha e a distribuição das células em toda a espessura da seção.
   NOTA: A distribuição de neurônios marcados com BrdU é usada como um guia para determinar as zonas de guarda necessárias. Embora uma distribuição uniforme de células seja crítica, observar menos células perto da parte superior e inferior da seção é aceitável, indicando o efeito de tampas perdidas.
   1. Amostra de neurônios marcados com BrdU e registre sua posição z junto com a espessura da seção local medida no canto selecionado de cada quadro de contagem.
   2. Plote o número de neurônios BrdU positivos em função de sua posição z.
3. A altura das zonas directoras e de protecção deve ser fixada com base na espessura média da secção e na distribuição das células (ver 3.1 e 3.2).
   NOTE:<span style='font-family:Arial,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > A altura do dissector deve ser menor que a espessura da seção para evitar artefatos próximos às superfícies. Este risco é contornado com a inclusão de zonas de proteção na parte superior e inferior da seção.
4. Determine o comprimento do passo entre os dissectores.
   1. Delineie a região de interesse em todas as seções a serem analisadas e registre as áreas.
   2. Some essas áreas e divida pelo número de dissecadores colocados dentro dessa área.
      NOTE:<span style='font-family:Arial,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > Com base na experiência anterior, um bom ponto de partida envolve 75 sondas. Isso aproximará a área e as posições de amostragem correspondentes (A_step).
   3. Pegue a raiz quadrada de A_step, que fornecerá o tamanho x-y-step.
5. Determine o tamanho do quadro de contagem.
   1. Defina o tamanho do quadro de contagem para uma unidade arbitrária e execute uma amostragem piloto de neurônios BrdU-positivos usando os parâmetros obtidos nas seções 3.3 e 3.4.
      NOTE:<span style='font-family:Arial,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > O tamanho deve ser determinado empiricamente por tentativa e erro, mas recomenda-se o ajuste para permitir a amostragem de 2-3 células por dissetor.
6. Após esta etapa final do estudo piloto, comece a amostragem de células.
   NOTA: Os parâmetros de amostragem obtidos devem resultar em contagens de aproximadamente 150-200 células em cada animal, suficientes para obter um desenho estereológico eficiente.
7. Conte os neurônios positivos para BrdU usando uma objetiva de imersão em óleo de 100× e uma ampliação final de 2000-3000×. Em cada dissector óptico, identifique quaisquer neurônios marcados com BrdU que sejam reconhecidos pela característica de interesse (no presente estudo, o critério é quando a borda de ataque do neurônio marcado com BrdU entra em foco pela primeira vez), estão localizados dentro do quadro de contagem ou toque nas linhas de inclusão (Figura 2B). Não conte os neurônios BrdU-positivos que tocam as linhas de exclusão quando claramente reconhecidos pela característica de interesse dentro da altura do dissector. É extremamente importante seguir cuidadosamente essas regras de contagem ao longo de toda a quantificação estereológica.
   NOTE:<span style='font-family:Arial,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > Como o BrdU se incorpora a todas as células em divisão, a morfologia distingue entre neurônios e outros tipos de células. As características dos neurônios são um núcleo claramente definido com um citoplasma neutro e um nucléolo escuro. As células BrdU positivas são reconhecidas como neurônios recém-formados com base em seu tamanho maior do que as células gliais. Em estudos de proliferação de curto prazo (por exemplo, < 2,4 h), a coloração dupla usando marcadores neuronais imaturos pode ser um pré-requisito.

Results

Materials