Imagens ao vivo do olho de pupa de Drosophila usando microscopia de fluorescência

Resumo

Fonte: Hellerman, M. B., et al. Imagens ao vivo do olho de pupa de Drosophila. J. Vis. Exp. (2015)

O vídeo demonstra uma técnica de imagem ao vivo para estudar o padrão dos olhos em uma pupa de Drosophila melanogaster. Os marcadores marcados com proteína fluorescente verde (GFP) permitem a visualização da organização e diferenciação celular durante a formação da estrutura ocular em desenvolvimento.

Protocolo

1. Imagem de fluorescência

1. Imagem da Drosophila preparação pupal usando um microscópio fluorescente. A cada 7 min capturam cortes seriados através do domínio apical do neuroepitélio ocular, na região das junções aderentes.
   NOTA: a) As seções seriais apropriadas são geralmente de 4 a 5 por pilha z, compostas por etapas z de 0,2 μm. b) Irregularidades na topologia do epitélio, incluindo saliências e dobras leves, podem dificultar a aquisição de imagens em foco de grandes regiões de tecido. Ao fazer imagens, pode-se descobrir que parte de uma área de interesse está em foco e uma região vizinha está fora de foco. A inclusão de uma pequena gota de água destilada entre o olho da pupa e a lamínula pode eliminar algumas dobras agudas do tecido, mas não a topologia levemente irregular característica dos estágios iniciais da morfogênese do olho da pupa. Nesses casos, faça uma sobreamostragem do tecido estendendo a pilha z até que as fatias em foco sejam adquiridas para todo o campo. c) A captura de seções seriadas a cada 7 minutos deve permitir imagens ao vivo por 3 a 4 horas sem uma redução significativa na intensidade da fluorescência da proteína fluorescente verde (GFP) que pode comprometer a qualidade da imagem. Intervalos de tempo mais curtos podem reduzir o tempo total de imagem.
2. Continue a imagem por 3 a 4 horas. Não use uma função automática de foco e tempo que está disponível em muitos microscópios fluorescentes, pois o crescimento pupal e o bombeamento da hemolinfa movem a posição da retina e é necessário um refoco vigilante a cada 14-21 min.

OBSERVAÇÃO: Exames de imagem além de 4 horas podem retardar ou interromper a morfogênese do olho.

3. Use o software de deconvolução apropriado para reduzir o fundo e melhorar o contraste das imagens da seção serial. Para cada arquivo z-stack, execute o seguinte no software de fluorescência avançada (LAS AF) do Leica Application Suite: Navegue até o painel Ferramentas, selecione Deconvolução 3D e clique em Aplicar.
4. Gerar uma imagem de projeção máxima (MP) para cada arquivo de pilha descomplicado: Navegue até o painel Ferramentas, selecione Projeção 3D e clique em Aplicar.
   NOTA: O algoritmo MP pode falhar ao gerar uma imagem uniformemente em foco para o tecido que foi superamostrado.

2. Processamento de imagem

1. Alinhamento automático de imagem:

NOTA:} O tecido vivo Drosophila} se deslocará e crescerá ao longo do processo de imagem. Consequentemente, os centros das imagens coletadas em pontos de tempo sucessivos podem não corresponder ao mesmo ponto no tecido Drosophila. Além disso, todo o disco retiniano gira cerca de 30° entre ~21 e 23 horas após a formação do pupário (APF). Para destacar comportamentos celulares individuais e reduzir as distrações causadas pelo crescimento do organismo, alinhe cada imagem MP. Embora isso possa ser feito manualmente, o software de edição de imagem usado aqui possui algoritmos integrados que podem agilizar o processo.

2. Na guia Arquivo do menu principal, abra Scripts e selecione Carregar arquivos na pilha.
3. Importe os arquivos de imagem MP para o painel Carregar camadas e selecione OK. Certifique-se de que a opção Tentar alinhar imagens de origem não esteja selecionada automaticamente.
4. NOTA: Se esta opção for selecionada, o software pode usar um algoritmo de alinhamento que distorce os dados da imagem.
5. Depois que todos os arquivos MP forem carregados no painel Camadas, certifique-se de que todas as imagens estejam em ordem cronológica, de modo que o ponto de tempo mais antigo esteja no topo da pilha de camadas. Se as camadas não estiverem na ordem correta, arraste e solte-as até que sejam ordenadas corretamente.
6. Selecione Alinhar camadas automaticamente na guia Editar do menu principal. Escolha Reposicionar e clique em OK.
7. Se o algoritmo de Alinhamento automático não conseguir orientar os quadros para um ponto focal relevante, faça pequenos ajustes usando a ferramenta Mover.

Materiais

< classe de figura='tabela'>< estilo col='largura:33,33%;'>< estilo col='largura:33,33%;'>< estilo col='largura:33,34%;'>Lista de materiais utilizados neste artigo Nome Empresa Número de catálogo Comentários GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Caderina:GFP; + / SM5-TM6b 25 x 75 x 1 mm lâmina de microscópio de vidroFisher Scientific12-550-41322 x 40 mm lamínula de vidroVWR48393-172FórcepsFine Science Tools91150-20Whatman 3 mm papel de cromatografiaFisher Scientific05-713-336VaselinaFisher Scientific19-086-29130 ml seringaFisher ScientificS7510-30Adobe Photoshop CS5Adobe Leica TCS SP5 DM microscópioLeica Microsystems LAS AF Versão 2.6.0.7266 software de microscópioLeica Microsystems