Imagem longitudinal de dois fótons de neurônios marcados com fluorescência em um hipocampo de camundongo vivo

Resumo

Fonte: Ulivi, A. F., et. al. Imagem longitudinal de dois fótons do hipocampo dorsal CA1 em camundongos vivos. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra imagens longitudinais de dois fótons de neurônios piramidais marcados com fluorescência em um camundongo vivo, apresentando a preparação, alinhamento da cânula e imagem de dendritos e espinhas dendríticas para estudar a estrutura neuronal na região CA1 do hipocampo.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação da sessão de imagem
2. Ative a configuração da imagem com antecedência e deixe o laser aquecer e estabilizar, se necessário.
3. Anestesie o mouse. Coloque o mouse na câmara de indução de anestesia a 3% de isoflurano em 1 L/min O₂ e espere até que perca a consciência. Avalie a anestesia usando o teste do reflexo de pinça do dedo do pé.
4. Use uma pinça para remover cuidadosamente o filme adesivo da placa de suporte da cabeça. Segure o mouse com a mão e a placa de suporte da cabeça com os dedos. Remova o filme com cuidado, para evitar danificar a preparação.
5. Posicione o mouse sob o microscópio, sobre o tapete de aquecimento, e prenda a placa da cabeça ao suporte (Figura 1D).
6. Posicione o cone do nariz para cobrir o focinho e diminua o isoflurano para 1,5-2%.
7. Aplique pomada oftálmica nos olhos do camundongo.
8. Limpe a cânula de imagem enxaguando-a com água deionizada. Use uma seringa e uma agulha fina para colocar água na cânula e uma bomba de vácuo para removê-la.

2. Sessão de imagem

1. Use objetivas de baixa ampliação e longa distância de trabalho para verificar visualmente a cânula quanto a água residual, sujeira, integridade e presença de fluorescência.
2. Alinhe a cânula ao eixo óptico ajustando os ângulos dos braços do suporte da cabeça.
3. Mude para as objetivas de imersão em água 25X 1.0 NA (abertura numérica), 4 mm WD (distância de trabalho) ou 40X 0.8 NA, 3 mm WD. Adicione água deionizada suficiente para encher a cânula e mantenha o excesso de água em cima da cânula. Evite a formação de bolhas de ar.
4. Use excitação de dois fótons (2P) e sinais fluorescentes de imagem.
   NOTA: O protocolo de imagem é altamente dependente das escalas de tempo e espacial a serem visualizadas. Consulte os resultados representativos da seção e a discussão para obter detalhes sobre as configurações de imagem que usamos para produzir as imagens mostradas neste artigo.

Resultados

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de aço inoxidável Ø 3,0 x 0,25 mm (Ø interno 2,5 mm) L = 500 mm	Sawade	R00303	Tubo de aço inoxidável para o anel de metal da cânula
Microscope Cover glass (4 mm round)	Engelbrecht Medizin e Labortechnik		Lamínulas de vidro para a cânula de vidro
Isofluran CP, Flasche 250 ml	Henry Schein VET GmbH	798932	Liquid isoflurano para anestesia
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer	Harvard Apparatus GmbH	34-1040	Vaporizador de isoflurano
Lab Active Scavenger	Gropper Medizintechnik	UV17014	Isoflurano sistema de limpeza
CMA 450 Temperature Controller	Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH	8003770	Cobertor de aquecimento
Bepanthen Augen- und Nasensalbe	Bayer AG		Ophtalmic oftalmic
Head plates	Custom feito		30 mm x 10 mm tamanho; orifício de 8 mm de diâmetro, titânio
Head plate clamp	Feito sob medida		Head plate holder
Suportes de postes de pedestal	Thorlabs	PH20E/M	Suporte da placa da cabeça
Poste de aço inoxidável	Thorlabs	TR30/M	Suporte da placa da cabeça
Poste de aço inoxidável	Thorlabs	TR75/M	Suporte da placa da cabeça
Poste de aço inoxidável	Thorlabs	TR150/M	Suporte da placa da cabeça
Post grampos do conector	Custom made		Suporte da placa de cabeça
Placa de ensaio de alumínio, 300 mm x 450 mm x 12,7 mm, M6 Taps	Thorlabs	MB3045/M	Estágio do microscópio
7" x 4" Lab Jack	Thorlabs	L490/M	Estágio do microscópio
Low profile face mask small mice	Emka Technologies	VetFlo-0801	Suporte de máscara facial de anestesia
Power Meter Model 1918-R	Newport		Medidor de potência
X-Cite 120Q	Excelitas Technologies		Lâmpada de fluorescência
Microscópio de dois fótons	Bruker	Ultima IV	Microscópios de dois fótons
Microscópio de dois fótons	Thorlabs	Bergamo	Microscópios de dois fótons
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22	Olympus		Objetivos
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22	Olympus		Objectives
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5	Olympus		Objetivos
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18	Olympus		Objectives
Ultafast laser sintonizável para excitação 2P	Spectraphysics	Mai Tai Deep See	Excitaiton lasers
Ultafast laser sintonizável para excitação 2P	Spectraphysics	InSight DS+ Dual beam	Excitaiton lasers
Ultafast laser sintonizável para excitação 3P	Coerente	Monaco	Excitaiton Lasers