Imagem longitudinal de dois fótons de neurônios marcados com fluorescência em um hipocampo de camundongo vivo

Resumo

Fonte: Ulivi, A. F., et. al. Imagem longitudinal de dois fótons do hipocampo dorsal CA1 em camundongos vivos. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra imagens longitudinais de dois fótons de neurônios piramidais marcados com fluorescência em um camundongo vivo, apresentando a preparação, alinhamento da cânula e imagem de dendritos e espinhas dendríticas para estudar a estrutura neuronal na região CA1 do hipocampo.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação da sessão de imagem
2. Ative a configuração da imagem com antecedência e deixe o laser aquecer e estabilizar, se necessário.
3. Anestesie o mouse. Coloque o mouse na câmara de indução de anestesia a 3% de isoflurano em 1 L/min O₂ e espere até que perca a consciência. Avalie a anestesia usando o teste do reflexo de pinça do dedo do pé.
4. Use uma pinça para remover cuidadosamente o filme adesivo da placa de suporte da cabeça. Segure o mouse com a mão e a placa de suporte da cabeça com os dedos. Remova o filme com cuidado, para evitar danificar a preparação.
5. Posicione o mouse sob o microscópio, sobre o tapete de aquecimento, e prenda a placa da cabeça ao suporte (Figura 1D).
6. Posicione o cone do nariz para cobrir o focinho e diminua o isoflurano para 1,5-2%.
7. Aplique pomada oftálmica nos olhos do camundongo.
8. Limpe a cânula de imagem enxaguando-a com água deionizada. Use uma seringa e uma agulha fina para colocar água na cânula e uma bomba de vácuo para removê-la.

2. Sessão de imagem

1. Use objetivas de baixa ampliação e longa distância de trabalho para verificar visualmente a cânula quanto a água residual, sujeira, integridade e presença de fluorescência.
2. Alinhe a cânula ao eixo óptico ajustando os ângulos dos braços do suporte da cabeça.
3. Mude para as objetivas de imersão em água 25X 1.0 NA (abertura numérica), 4 mm WD (distância de trabalho) ou 40X 0.8 NA, 3 mm WD. Adicione água deionizada suficiente para encher a cânula e mantenha o excesso de água em cima da cânula. Evite a formação de bolhas de ar.
4. Use excitação de dois fótons (2P) e sinais fluorescentes de imagem.
   NOTA: O protocolo de imagem é altamente dependente das escalas de tempo e espacial a serem visualizadas. Consulte os resultados representativos da seção e a discussão para obter detalhes sobre as configurações de imagem que usamos para produzir as imagens mostradas neste artigo.

Resultados

Materiais