Investigando as origens dos neurônios sensoriais na dura-máter usando microscopia de fluorescência

Resumo

Source: <a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove. com/v/61742/visualizaizing-the-calcitonin-gene-related-peptide-immunoreactive-innervation-of-the-rat-cranial-dura-mater-with-immunofluorescence-and-neural-tracing'>Wang, J., et al. Visualizando a inervação imunorreativa do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina da dura-máter craniana de ratos com imunofluorescência e rastreamento neural. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra um método para rastrear as origens dos neurônios sensoriais na dura-máter usando microscopia de fluorescência. Um traçador retrógrado é introduzido na dura-máter exposta de um rato anestesiado. O traçador é captado pelos axônios neuronais sensoriais e viaja retrógradamente para seus corpos celulares dentro do gânglio trigêmeo e dos gânglios da raiz dorsal cervical. Os gânglios são então seccionados, corados com anticorpos que marcam o marcador e os neuropeptídeos nos corpos celulares e analisados usando microscopia de fluorescência para confirmar as origens ganglionares dos neurônios sensoriais.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo veterinário JoVE conselho de revisão.

1. Estudo de rastreamento retrógrado com fluorogold (FG)

1. Procedimentos cirúrgicos
   1. Determine a área de coordenadas de interesse na dura-máter craniana de rato.
   2. Prepare uma microseringa de 10 μL e teste-a com parafina líquida.
   3. Anestesiar os ratos com solução de tribromoetanol (150 mg/kg) por injeção intraperitoneal. Verifique a profundidade da anestesia pela falta de resposta ao beliscão do dedo do pé.
   4. Raspe a cabeça do rato com um barbeador elétrico.
   5. Coloque barras de orelha cegas no rato e coloque-o no dispositivo estereotáxico. Em seguida, coloque o suporte bucal e aplique pomada oftálmica nos olhos.
   6. Limpe o local cirúrgico da pele da cabeça com iodopovidona a 10% seguido de etanol a 75%.
   7. Faça uma incisão ao longo da linha média do couro cabeludo.
   8. Remova sem rodeios o periósteo e os tecidos musculares do crânio usando aplicadores estéreis com ponta de algodão (Figura 1A).
   9. Faça um pequeno furo (~ 5-7 mm) usando uma broca de rebarbas com uma broca de ponta redonda (# 106) nos ossos parietais e temporais esquerdos acima da artéria meníngea média (MMA) e certifique-se de que a dura-máter craniana foi mantida intacta (Figura 1B).
   10. Construa um banco ao redor do orifício com cimento de silicato dental para limitar a propagação do traçador (Figura 1C).
   11. Adicione 2 μL de 2% de FG no orifício ao redor do MMA com uma microseringa de 10 μL (Figura 1D).
   12. Cubra o buraco com um pequeno pedaço de esponja hemostática.
   13. Coloque um pedaço de filme de parafina no orifício e sele as bordas com cera óssea para evitar o vazamento do traçador e para evitar contaminar os tecidos circundantes.
   14. Suturar a ferida com fio estéril.
   15. Mantenha os ratos em uma área quente até que eles se recuperem totalmente.
   16. Devolva os ratos de volta às gaiolas e adicione um antibiótico e analgésico à água potável.
2. Perfusões e seções
   1. Após 7 dias de sobrevivência, perfunda esses ratos.
   2. Disseque o gânglio do trigêmeo (TG) e os gânglios da raiz dorsal C1-4 (DRGs), depois os fixe e crioproteja-os (Figura 1F).
   3. Corte os TG e DRGs com espessura de 30 μm em um sistema de micrótomo criostato na direção sagital e montado em lâminas de vidro revestidas com silano.
3. Imunofluorescências duplas para marcação de peptídeos relacionados ao gene FG e calcitonina (CGRP) nos TG e DRGs
   NOTA: Embora a marcação FG possa ser observada diretamente com iluminação ultravioleta (UV) sob lâmpada de mercúrio sem coloração adicional, os neurônios marcados com FG foram examinados posteriormente em TG e DRGs cervicais usando imunofluorescências duplas com FG e CGRP para revelar as origens do CGRP-imunorreativo dural fibras nervosas no TG e DRGs.
   1. Circule as seções com a caneta histoquímica.
   2. Incube as seções por 30 min em uma solução de bloqueio contendo 3% de soro de burro normal e 0,5% de Triton X-100 em tampão fosfato 0,1 M (PB).
   3. Transferir as amostras para a solução de anti-fluorogold de coelho (1:1000) e anticorpo anti-CGRP de ratinho (1:1000) em PB 0,1 M contendo 1% de soro normal de burro e 0,5% de Triton X-100 durante a noite a 4 °C.
   4. Lave as seções três vezes em 0.1 M PB no dia seguinte.
   5. Incubar em uma solução mista de anticorpo secundário anti-coelho Alexa Fluor 594 (1:500) e anti-rato Alexa Fluor 488 (1:500) em PB 0,1 M contendo 1% de soro de burro normal e 0,5% de Triton X-100 por 1,5 h em temperatura ambiente.
   6. Lave e aplique lamínulas nas seções.
4. Observação e gravação
   1. Tire imagens dos neurônios marcados com FG em TG e DRGs sob iluminação UV por microscópio fluorescente equipado com uma câmera digital.
   2. Capture imagens dos neurônios marcados com FG e CGRP em TG e DRGs sob um microscópio fluorescente equipado com uma câmera digital.
   3. Use o software de edição para ajustar o brilho e o contraste das imagens e adicionar rótulos nas imagens.

Resultados

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Alexa Fluor 488 burro anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A21202	Proteger da luz; RRID: AB_141607
Brain stereotaxiis instrument	Narishige	SR-50
CellSens Dimension	Olympus	Versão 1.1	Software de microscópio fluorescente
Fluorogold (FG)	Fluorochrome	52-9400	Protect from light
Fluorescent imaging system	Olympus	BX53
Freezing microtomme	Thermo	Microm InternationalGmbH
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Mouse anti-CGRP	Abcam	ab81887	RRID: AB_1658411
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin 568	Molecular Probes	A12380	Protect from light
Photoshop e Ilustração	Adobe	CS6	Software de edição de fotos
Rabbit anti-Fluorogold	Abcam	ab153	RRID: AB_90738
Sprague Dawley	Institutos Nacionais de Controle de Alimentos e Medicamentos	SCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus microscope slides	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm