Monitoramento da recuperação de células interneuromast abladas por laser em peixe-zebra usando microscopia confocal

Resumo

Source: Volpe, B. A., et al. ensaio de ablação e regeneração a laser baseado em microscópio confocal em células interneuromast de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra o monitoramento da recuperação de células interneuromastóides em peixe-zebra usando microscopia confocal, rastreando a morte e o reparo celular por meio de imagem de fluorescência com lapso de tempo.

Protocolo

1. Imagem pós-ablação e microscopia de lapso de tempo para estudar regeneração

1. Clique no menu suspenso para "Channels". Nos canais, desmarque a opção "DAPI "(4 ′, 6-diamidino-2-fenilindo) para inativar o laser de ablação. Clique no menu suspenso para "Acquisition mode".
2. No modo de aquisição, clique em "Zoom".
3. Diminua o zoom para 0,7 usando o controle deslizante ou digitando "0.7."
   1. Para garantir uma ablação celular bem-sucedida, aumente o ganho para 900 e verifique rapidamente o campo de visão.
      NOTE:<span style='font-family:Roboto,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > Nenhuma GFP (proteína fluorescente verde) deve ser visível dentro da célula ou células alvo. Usando as mesmas configurações ou configurações semelhantes às descritas para imagens pré-ablação, capture e salve uma imagem pós-ablação (Figura 1C). Se a imagem revelar restos de células fluorescentes ou corpos celulares adicionais que precisam ser removidos, repita as etapas de ablação a laser para criar uma lacuna visível na cadeia de células interneuromastóideas.
   2. Inspecione a imagem do canal T-PMT (Tubo Fotomultiplicador de Transmissão) para confirmar ainda mais os danos celulares. As células danificadas terão uma aparência granular e os núcleos freqüentemente incharão ou se tornarão irregulares em forma (Figura 2).
4. Depois de capturar uma imagem de pré-ablação, ablação das células conforme necessário e capturar uma imagem de pós-ablação para cada posição individual do palco, configure a microscopia de lapso de tempo ativando as opções de posição do estágio e tempo para captura de imagem. Defina os parâmetros de tempo para 24 h ou outro ponto final desejado e intervalos de 15 minutos. Inicie o experimento para adquirir imagens e salve o arquivo resultante quando concluído (no dia seguinte).
5. Se as larvas forem estudadas ou criadas posteriormente, remova-as cuidadosamente da agarose usando uma pinça fina e, em seguida, transfira-as para o meio E3 sem tricaína para recuperação. Se não forem usados mais, eutanasiar de acordo com o protocolo animal aprovado (imersão rápida e sustentada em banho de gelo é um método comum) e descartá-los conforme exigido pela instituição.

Resultados

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
12-well PTFE Printed Slides	Electron Microscopy Sciences	63425-05
15 mM Tricaine stock solution	Sigma	E10521	15 mM Tricaine em osmose reversa water
1X E3 + 600 μM Tricaine			Diluir 15 mM Tricaine stock 25X em 1X E3 media
1X E3 media			Diluir mídia E3 60X para 1X em água de osmose reversa (16,7 ml/L)
60 X E3 media	Todos os componentes adquiridos da Sigma-Aldrich		34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 em 1 litro de água de osmose reversa
Bx60 Microscópio composto com fluorescência de lâmpada de arco de mercúrio	Olympus
LSM 700 microscópio confocal equipado com lasers de 405 nm, 488 nm e 555 ou 561 nm	Carl Zeiss Microscopy, LLC		Um laser de 5 mW 405 nm foi usado para ablação; As ablações e imagens foram realizadas através de uma objetiva Plan-Apochromat de 63x com um NA de 1,40
FIJI/ImageJ Software de processamento de imagem	Vários colaboradores		Transferível em https://fiji.sc/
Agulha de dissecação modificada em faca de cabelo	Fisher Scientific	19010	Um cílio foi colado na ponta de uma agulha de dissecação com cabo de madeira
Microsoft Excel software	Microsoft Corp.		Google sheets é uma alternativa gratuita ao Microsoft Excel
Antenas com fundo de vidro de 35 mm com lamínula nº 1,5, janela de 20 mm	Mattek Corporation	P35G-1.5-20-C	35 mm placa de Petri, janela de vidro de 20 mm
Immersol 518F Immersion Oil	Fisher Scientific	12-624-66A
Low Gelling Agarose	Sigma Life Science	A9414-256
Inserção Corning Netwell com malha de poliéster de 74 um, inserção de 24 mm	Millipore Sigma	CLS3479-48EA
Rstudio software	Rstudio PBC		Transferível em https://rstudio.com/
SMX-168-BL Microscópio estéreo	Motic
Transfer Pipeta	Fisher Scientific	13-711-7M
ZEN software	Carl Zeiss Microscopy, LLC