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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pela revisão ética animal apropriada comitê.
1.Preparar Buffer de Krebs modificado.
Faça um tampão de Krebs modificado de modo que as concentrações finais (em mM) dos componentes sejam as seguintes: 121 NaCl, 5.9 KCl, 2.5 CaCl2, 1.2 MgCl2, 1.2 NaH2PO4, 10 HEPES, 21.2 NaHCO3, 1 ácido pirúvico e 8 glicose (pH ajustado para 7,4 com NaOH). Adicione 3 μM de nicardipina e 1 μM de escopolamina para inibir as contrações musculares durante Ca2+ imagens e dissecções de montagem total.
2. Imagem e Análise
OBSERVAÇÃO: Use pelo menos um equipamento de imagem básico com uma fonte de luz fluorescente, microscópio, uma câmera CCD de qualidade e software de aquisição apropriado. Varie a adição de outros componentes dependendo da fonte de luz e da aplicação específica. Uma roda de filtro e obturador devem ser usados com uma fonte de luz de arco de xenônio tradicional. No entanto, as fontes de luz LED e os sistemas de iluminação não requerem esses componentes.
- Posicione a câmara de gravação sob o microscópio e, usando um sistema de perfusão por fluxo por gravidade com vários reservatórios de seringa aquecidos, estabeleça uma taxa de perfusão contínua de 2–3 ml/min de tampão Krebs a 37 °C. Certifique-se de evitar a formação de bolhas de ar na linha de entrada e sucção conectada a um purgador de vácuo.
- Traga o plexo desejado em foco sob iluminação de campo claro. Evite a superexposição do tecido, o que pode levar ao fotobranqueamento.
- Examine a carga do Fluo-4 dentro dos gânglios e selecione gânglios saudáveis para obter imagens. Os gânglios insalubres/danificados exibirão autofluorescência ou morfologia pontilhada e não devem ser usados para geração de imagens.
- Uma vez que o gânglio é selecionado, desvie o caminho da luz para a câmera e obtenha a imagem ao vivo com o software de aquisição de imagem. Certifique-se de que o gânglio esteja em foco e defina a taxa de aquisição de imagem e os tempos de exposição.
NOTA: As taxas e tempos de aquisição de imagens variam de acordo com os eventos que os investigadores desejam registrar. Para a maioria dos experimentos, as imagens são tradicionalmente adquiridas a 0,5-1 Hz para células gliais e até 2-10 Hz para neurônios porque glial Ca2+ respostas não são tão rápidas quanto Ca2+ transientes em neurônios. - Comece o experimento e estabeleça a atividade de linha de base por 30 segundos.
- Aplique drogas pré-aquecidas de interesse, como agonistas e antagonistas de receptores, usando o sistema de perfusão de fluxo por gravidade a uma taxa de 2-3 ml / min. Siga a aplicação de agonistas / antagonistas retornando a uma perfusão de tampão normal e permita um período de lavagem / recuperação de pelo menos 10 min.
NOTE:<span style='font-family:Arial,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > Os tempos de aplicação do medicamento variam dependendo do composto individual e do projeto experimental. Em geral, uma aplicação de agonista de 20 a 30 segundos é suficiente para ativar os receptores acoplados à proteína G em neurônios e células gliais. No entanto, os canais iônicos dependentes de ligantes (como os receptores nicotínicos de acetilcolina) requerem tempos de aplicação não superiores a 5-10 segundos. Exposições de duração adicional farão com que os canais iônicos dependentes de ligantes se dessensibilizem rapidamente. Os antagonistas devem ser aplicados por aproximadamente 3-15 minutos para garantir o bloqueio completo das vias receptoras. No entanto, esta é uma generalização grosseira e os investigadores devem sempre otimizar qualquer medicamento experimental em seu paradigma particular. - Pare a gravação e veja o filme de lapso de tempo do experimento. Selecione cuidadosamente as regiões de interesse (ROI's) usando o software de análise de imagem apropriado.
- Use o software para normalizar e comparar a intensidade fluorescente do ROI com seu valor fluorescente inicial da linha de base. As alterações na fluorescência normalizada são diretamente proporcionais às alterações em [Ca2+].
- Use uma modificação de um método descrito anteriormente usando ΔF/F = ((F1− F0)/F0)ROI − ((F1− F0)/F0)background, onde F1 é a fluorescência em qualquer ponto e F0 é a fluorescência da linha de base, para melhorar a precisão da avaliação. Essa modificação ajuda a reduzir o ruído das alterações de fluorescência nas preparações teciduais que exibem movimento da camada muscular subjacente ao plexo mioentérico.