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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Preenchendo astrócitos com iontoforese
- Teste o eletrodo.
- Coloque uma fatia de cérebro delicadamente em um prato com fundo de vidro cheio de 0,1 M PBS em temperatura ambiente. Segure a fatia no lugar com uma harpa de platina com cordas de náilon.
- Certifique-se de que o eletrodo esteja conectado a um voltage fonte e coloque o eletrodo de aterramento no banho contendo a fatia de cérebro.
- Mova o objetivo para a região do cérebro de interesse.
- Abaixe o eletrodo na solução. Sob o campo claro, mova-o para o centro do campo de visão e examine-o cuidadosamente com a lente de imersão em água de 40x para garantir que pareça claro e sem detritos ou bolhas. Se houver algo entupindo a ponta do eletrodo, substitua-a por uma nova.
NOTA: O entupimento é uma preocupação para o eletrodo de 200 MΩ. Com centrifugação e filtração da solução de corante antes de cada experimento, isso não deve ser um problema frequente. No entanto, como a ponta do eletrodo é pequena, o tecido às vezes pode ficar preso na abertura. Os autores não encontraram uma maneira de evitar isso, mas pode ser facilmente resolvido simplesmente usando um novo eletrodo. - Sob o campo claro, abaixe lentamente o eletrodo em direção à fatia, parando logo acima da superfície.
- Encha o astrócito com iontoforese.
- Identifique astrócitos 40−50 μm abaixo da superfície da fatia com o contraste de interferência diferencial infravermelho (IR-DIC). Procure células com somata alongada e oval com cerca de 10 μm de diâmetro. Depois que um astrócito for escolhido, mova-o para o centro do campo de visão.
NOTA: Uma boa célula para iontoforese tem bordas claras e definidas ao seu redor. Não escolha células muito próximas da superfície da fatia porque elas não podem ser completamente preenchidas. É preciso um pouco de prática ao longo de alguns dias para ser capaz de identificar rotineiramente astrócitos para preenchimento de corante. Dependendo da área do cérebro usada para o experimento, o número de astrócitos pode variar. Isso pode afetar o tempo necessário para identificar um astrócito antes do enchimento. - Abaixe lentamente a ponta do eletrodo na fatia, navegando pelo tecido, até que esteja no mesmo plano do corpo celular.
NOTA: Mova o eletrodo lentamente para evitar danificar o tecido. - Uma vez que o corpo celular do astrócito esteja claramente visível e delineado, avance lenta e suavemente o eletrodo para frente. Mova o eletrodo até que a ponta empale o soma da célula. Mova o foco da objetiva lentamente para cima e para baixo para observar se o eletrodo está dentro do soma.
NOTA: A ponta do eletrodo deve estar dentro do corpo celular e um pequeno recuo no soma deve ser observado. Não mova mais o eletrodo para evitar que a ponta atravesse a célula. - Assim que a ponta do eletrodo estiver dentro da célula, ligue o estimulador em ~0,5−1 V e ejete continuamente a corrente para dentro da célula. Usando o microscópio confocal, observe o enchimento da célula. Aumente o zoom digital para ver os detalhes da célula e certifique-se de que a ponta do eletrodo esteja visível dentro da célula.
NOTA: Diminua a tensão se parecer que o corante está vazando da célula ou preenchendo outras células nas proximidades. Se parecer que o corante ainda está vazando para fora da célula, puxe o eletrodo lentamente e encontre outra célula. É importante que o corante não vaze para ter uma alta relação sinal/fundo na imagem final. - Aguarde cerca de 15 min até que os ramos e processos mais finos pareçam definidos, desligue a tensão e retire suavemente a ponta do eletrodo da célula.
- Imagem da célula preenchida.
NOTA: A imagem pode ser realizada imediatamente após o preenchimento. Uma objetiva com uma abertura numérica (NA) mais alta resulta em melhor resolução. - Aguarde até que a célula retorne à sua forma original antes de obter imagens (15 a 20 min) com objetiva de 40x. Para criar imagens da célula, ajuste a configuração no confocal para garantir que as ramificações e processos mais finos pareçam definidos.
- Configure uma pilha z com um tamanho de passo de 0,3 μm. Durante a imagem, mova a objetiva até que não haja sinal da célula e defina-a como o topo. Em seguida, mova o objetivo para baixo (focando através da célula) até que não haja sinal, defina-o como a parte inferior.