Incorporando o cérebro de Drosophila em uma matriz para imagens de lapso de tempo dos neurônios do relógio circadiano

Resumo

Source:<a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove. com/v/57015/single-cell-resolution-fluorescence-live-imaging-of-drosophila-circadian-clocks-in-larval-brain-culture'> Sabado, V., et al., Nagoshi, E. Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Relógios circadianos na cultura do cérebro larval. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra o procedimento para incorporar o Drosophila cérebro em uma matriz de fibrina, seguido por imagens de fluorescência de lapso de tempo de neurônios do relógio circadiano para analisar a atividade rítmica sincronizada com ciclos claros/escuros.

Protocolo

1. Incorporação de explantes cerebrais em uma matriz 3D e montagem (~20 min).
   1. Mergulhe um cérebro dissecado em solução de trabalho de fibrinogênio (concentração final de fibrinogênio ~ 3,3 mg / mL, 10,5 μL por cérebro) da seguinte forma:
   2. Aspire 3,5 μL de meio ativo schneider (SAM) / antibióticos. Aspire um cérebro dissecado da dissecção bem na mesma ponta de pipeta sem dispensar o meio SAM / antibióticos na ponta.
   3. Dispense o cérebro e o meio na tampa de uma placa de Petri estéril. Adicione mais 3,5 μL de SAM / antibióticos e 3,5 μL de fibrinogênio quente / solução SAM 10 mg / mL à gota contendo o cérebro. Misture suavemente a solução ao redor do cérebro pipetando com uma ponta de pipeta de 20 μL.
      NOTA: Usar uma pipeta em vez de uma pinça nesta etapa evita estressar o cérebro.
   4. Retire 2 μL da solução de trabalho de fibrinogênio da gota e aplique-a como um pequeno círculo na lamínula do prato com fundo de vidro. Adicione 0,8 μL de trombina e misture muito rapidamente com uma ponta de pipeta. O fibrinogênio é convertido em fibrina e começa a polimerizar.
   5. Pegue o cérebro que fica na solução de trabalho de fibrinogênio (passo 1.1) entre um par de pinças e posicione-o na matriz assim que uma matriz branca de fibrina estiver visível. Oriente o cérebro com o lado anterior para baixo (para neurônios do relógio de imagem). Empurre-o para baixo o mais próximo possível da lamínula. O coágulo de fibrina é composto por camadas de fibrina. Escolha uma camada e dobre-a no topo do cérebro com movimentos pequenos e suaves sem separar a matriz.
      1. Repita 2 a 3 vezes em diferentes partes do coágulo para estabilizar o cérebro.
         NOTA: Ao manusear o cérebro com fórceps, tome cuidado para não secá-lo ou impor estresse físico a ele.
   6. Adicione 20 μL de SAM/antibióticos no topo do cérebro incorporado para interromper a ação da trombina.
   7. Repita o procedimento para montar os cérebros restantes. Até cinco a seis cérebros podem ser embutidos em um prato com fundo de vidro.
   8. Para imagens ao vivo de longo prazo, adicione 600 μL de SAM/antibióticos no poço interno (a parte de vidro). Posicione uma membrana de politetrafluoretileno (PTFE) pré-cortada na parte superior do meio e cole-a na graxa a vácuo aplicada na parte plástica da parte inferior (Figura 1A).

Resultados

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	Não tenho certeza se são exatamente os mesmos que temos no laboratório. Eu escolhi "adequado para cultura de células de insetos" sempre que disponível
CaCl2	Sigma-Aldrich	C7902
MgSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	230391
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
D-(+) Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1000
Insulin<	I0516-5ML
Penicilina-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
BIS-TRIS	Sigma-Aldrich	B4429
L-(−)-Ácido málico	Sigma-Aldrich	M7397
D-(+)-Trealose di-hidratada	Sigma-Aldrich	T0167
Ácido succínico	Sigma-Aldrich	S9512
Ácido fumárico	Sigma-Aldrich	F8509
α-ácido cetoglutárico	Sigma-Aldrich	K1128
Non-heat-inactivated, Feto Calf Serum (FCS) Mycoplasma e Virus rastreados	BioConcept Ltd. Amimed	2-01F30-I
HEPES-KOH, pH 7.4	E&K Scientific Products	EK-654011
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S5011
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Fibrinogen de plasma bovino	Calbiochem (Merck)	341573-1GM	CUIDADO: Nocivo por inalação, em contato com a pele e por ingestão. Manipular sob fluxo laminar
Trombina de plasma bovino	Sigma-Aldrich	T9549	CUIDADO: Perigo para a saúde, use luvas
PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH	Chi Scientific	custom made
Vaccum grease	Sigma-Aldrich	18405
35 mm Prato, Nº 1.5 Lamínula, Diâmetro do Vidro de 20 mm, Não Revestido	MatTek	P35G-1.5-20-C
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Plates	Fisherscientific	08-772A
Estéril 500 mL Steritop-GP 33 mm filtro superior de frasco rosqueado, 0,22 μm	Millipore	SCGPS05RE
Filme de politetrafluoretileno (PTFE)	Dupont	200A Filme FEP de Teflon
Millex-HV Unidade de filtro de seringa, 0,45 μm, PVDF, 33 mm, esterilizado por gama	Millipore	SLHV033RS
Millex-GV Unidade de filtro de seringa, 0,22 μm, PVDF, 33 mm, esterilizado por gama	Millipore	SLGV033RS
Prato de dissecação de vidro de três poços	Any company
Pinça fina, tamanho 5, Dumont	Fine Science Tools	11254-20
Tandem scanner microscópio confocal TCS SP5 invertido, com scanner ressonante e detectores foto-multiplicadores HyD	Leica microsystem CMS GmbH
Câmara de controle de temperatura	Life Imaging Services	O sistema de controle de temperatura CUBE & BOX, projetado sob medida
Controlador de umidade do palco-top	Life Imaging Services	custom made
Water Immersion Micro Dispenser: dispensador, micro-bomba estendida série MP6 e software do Controlador de Objetiva de Autoimersão	Leica microsystem CMS GmbH
Criação de pilha de soma e plug-in de desvio de correção 3D	ImageJ software
10x deconvolução iterativa	AutoQuant e software Imaris

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