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1. Plaqueamento das células
NOTA: Com base na experiência, cerca de 100.000 células viáveis por embrião são coletadas. Camundongos prenhes cronometrados de 2 a 3 meses de idade normalmente têm ninhadas de 8 a 10 embriões; portanto, uma estimativa aproximada para o rendimento total de células por camundongo prenhes cronometrado é de aproximadamente 1 milhão de células.
- Usando um hemocitômetro, faça uma contagem de células e dilua a suspensão para 2.000 células/μL usando meio de cultura de células. Triturar brevemente para misturar.
- Remova as lamínulas com solução de laminina da incubadora e aspire a solução de laminina restante das lamínulas revestidas usando um vácuo. Placa rapidamente para evitar que as lamínulas sequem completamente. Pipetar 100 μL (2,0 x 105 células/lamínula) em cada lamínula e colocar placas de Petri numa incubadora a 37 °C durante 1 h.
- Adicione cuidadosamente 3 mL de meio de cultura de células a cada placa e coloque de volta na incubadora a 37 °C. Pré-forma meias trocas 2 vezes por semana durante 2 semanas.
2. Infecção de cultura de células em 14 (dias in vitro) DIV com vetores
- virais adeno-associados (AAV)Para cada placa, prepare 1 mL de meio DMEM livre de soro com 1 μL de hSyn-GCaMP6f AAV (1,0 x 1013 titulação)
- Aspire o meio de cultura celular de cada placa e substitua por 1 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) livre de soro contendo hSyn-GCaMP6f. Coloque os pratos de volta na incubadora a 37 °C por 1 h.
- Aspire o meio livre de soro contendo AAVs e substitua por 3 mL de meio de cultura de células. Coloque os pratos de volta na incubadora a 37 °C. Descobrimos que 5-7 dias de infecção por AAV permitem níveis ideais de expressão de GCaMP. Continue a mudar de meio a cada 2-3 dias durante este período de infecção viral.
3. Imagem confocal ao vivo de Ca2+ entre 19-21 dias in vitro (DIV)
NOTA: A imagem pode ser feita entre 5-7 dias após a infecção viral. Esta é a janela ideal para obter a expressão visível do fluoróforo em níveis que permitem a detecção da atividade espontânea do Ca2+.
- Preparação de buffers de gravação
- Para fazer 1 L de tampão de gravação HEPES, adicione: 9,009 g de NaCl, 0,3728 g de KCl, 0,901 g de D-glicose, 2,381 g de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES), 2 mL de solução-mãe 1 M CaCl2 e 500 μL de solução-mãe 1 M MgCl2 a 800 mL de H 2 destilado estérilO. Traga o pH para 7,4 com NaOH. Leve para um volume final de 1 L.
- Para fazer 200 mL de tampão de registro de glutamato 20 μM, dilua 40 μL de solução estoque de glutamato 100 mM em 200 mL de tampão de registro HEPES descrito acima.
- Imagem confocal
- Encha uma placa de Petri estéril de 35 mm com 3 mL de tampão de gravação.
- Remover uma placa de Petri de 35 mm com culturas infectadas da incubadora a 37 °C. Usando uma pinça de ponta fina, pegue cuidadosamente a borda de uma lamínula e transfira-a rapidamente para a placa de Petri cheia de tampão de gravação. Colocar a lamínula restante no meio de volta na incubadora a 37 °C. Transporte a antena com o tampão de registo para o microscópio confocal.
- Inicie o software de imagem. Prossiga para a próxima etapa enquanto ele é inicializado.
- Inicie a bomba peristáltica e coloque a linha no buffer de gravação. Calibre a velocidade do fluxo para 2 mL/min.
- Transfira a lamínula infectada da placa de Petri de 35 mm para o banho de gravação.
- Usando a objetiva de imersão em água de 10x e a luz de campo claro (BF), encontre o plano de foco e procure uma região com alta densidade de corpos celulares de neurônios. Mude para a objetiva de imersão em água de 40x e use a luz BF para reorientar a amostra.
- Na janela "Lista de corantes" do FluoView, selecione AlexaFluor 488 e aplique-o.
- As expressões AAV podem ser variáveis; portanto, para evitar a superexposição e o fotobranqueamento dos fluoróforos, comece com configurações baixas de HV e potência do laser. Para o canal AlexaFluor 488, defina o alto voltage (HV) para 500, o ganho para 1x e o deslocamento para 0. Para a linha de laser 488, defina a potência para 5%. Para aumentar o volume efetivo fotografado no plano z, aumente o tamanho do orifício para 300 μm. Use a opção de varredura "foco x2" para ajustar de forma ideal os sinais de emissão para níveis de subsaturação. A partir daqui, as configurações podem ser ajustadas até que a visibilidade ideal de cada canal seja alcançada.
NOTA: Para capturar com precisão toda a gama de fluxos de Ca2+ com GCaMP, ajuste as configurações de HV e potência do laser da linha de base para permitir um aumento na intensidade fluorescente sem saturar demais o detector. - Depois que as configurações do microscópio forem otimizadas, mova a platina para localizar uma região com várias células exibindo alterações espontâneas na fluorescência GCaMP6f e concentre no plano desejado para a geração de imagens.
- Use a ferramenta "Clip rect" para recortar o quadro de imagem em um tamanho que possa atingir um intervalo de quadros de pouco menos de 1 segundo. Isso é necessário para definir o intervalo de imagem em 1 quadro por segundo.
- Defina a janela "Intervalo" com um valor de 1,0 e a janela "Num" com 600.
NOTA: Para fornecer diferentes buffers de gravação no ponto de tempo desejado (300 s), é importante calibrar a latência da bomba para fornecer a nova solução ao banho. Isso dependerá da taxa de perfusão da solução (2 mL / min) e do comprimento da linha usada para bombear a solução. - Para capturar um filme da série T, selecione a opção "Time" e use a opção de digitalização "XYt" para iniciar a geração de imagens.
- Observe a barra de progresso da imagem e mova a linha do buffer de gravação HEPES para o buffer de gravação de glutamato de 20 μM no ponto de tempo apropriado (por exemplo, se a latência da bomba for calibrada para fornecer solução a 60 s, mova a linha para o tampão de glutamato a 240 quadros para fornecer glutamato a 300 s).
- Quando a imagem estiver concluída, selecione o botão Série concluída e salve o filme da série t finalizado. Continue a perfundir 20 μM de glutamato por mais 5 minutos, de modo que os neurônios cultivados tenham sido expostos ao glutamato por um total de 10 minutos. Repita esse processo para cada lamínula a ser fotografada.
- Após a exposição adicional de 5 minutos a 20 μM de glutamato, remova a lamínula do banho e coloque de volta na placa de Petri de 35 mm contendo o tampão de gravação até que o dia da imagem seja concluído.