Imagem de placas beta-amilóide em seções de tecido cerebral por imunomarcação e coloração com curcumina

Resumo

Fonte: Maiti, P. et. al.,. Marcação e imagem de placas amilóides no tecido cerebral usando o polifenol natural curcumina. J. Vis. Exp.} (2019)

Este vídeo demonstra o procedimento de imagem de placas beta-amilóide em seções de tecido cerebral usando imunomarcação e coloração com curcumina. A imunomarcação fornece especificidade para beta-amiloide, enquanto a curcumina se liga seletivamente às fibrilas ricas em β folhas, melhorando a visualização. A co-localização da fluorescência vermelha e verde confirma a presença de placas.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo veterinário JoVE placa de revisão.                                                                  

1. Perfusão dos animais

1. Prepare o fixador e os tampões de perfusão.
   1. Prepare o tampão fosfato de sódio 0,1 M adicionando 80 g de cloreto de sódio (NaCl), 2 g de cloreto de potássio (KCl), 21,7 g de hidrogenofosfato dissódico (Na₂HPO₄·7H₂O), 2,59 g de di-hidrogenofosfato de potássio (KH₂PO₄) e água destilada dupla para perfazer um total de 1 L.
   2. Prepare paraformaldeído a 4% (PFA).
      1. Adicione 40 g de paraformaldeído a 1 L de solução salina tamponada com fosfato (PBS) (0,1 M, pH 7,4).
      2. Aqueça a solução de PFA a 60−65 °C e misture usando um agitador magnético.
         NOTA: O a temperatura não deve exceder 65 °C.
      3. Adicione algumas gotas de hidróxido de sódio (NaOH) (1 N) com um conta-gotas para dissolver completamente o PFA.
      4. Filtrar a solução de PFA com papel de filtro médio a fino e conservar a 4 °C.
         NOTA: O solução é bom por um mês.
2. Realize anestesia e perfusão animal.
   NOTE:<span style='font-family:Arial,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > B6SJL-Tg APP SwFlLon de doze meses, PSEN1*M146L*L286V, 1136799Vas/J ( 5x doença de Alzheimer familiar (5×FAD)) camundongos controle pareados por idade (n = 6 por grupo) foram comprados de fornecedores e criados no biotério da Saginaw Valley State University. A genotipagem foi confirmada por reação em cadeia da polimerase (PCR). Estilo humano < estilo de extensão = 'família de fontes: Arial, sans-serif; tamanho da fonte: 12pt; estilo da fonte: normal; variante da fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto: nenhum; alinhamento vertical: linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento; '> doença de Alzheimer (< estilo de extensão = 'cor de fundo: transparente; cor: #1a202c;' >AD) tecido cerebral inclui tecido cerebral pós-morte AD e tecido de controle correspondente à idade.
   1. Anestesiar o animal com um agente anestésico apropriado, como pentobarbital sódico (390 mg/kg de peso corporal), ou uma mistura de cetamina/xilazina (até 80 mg/kg de peso corporal de cetamina e 10 mg/kg de peso corporal de xilazina) por injeção intraperitoneal (agulha de 27 G e seringa de 1 mL). Verifique o nível de anestesia beliscando um dedo do pé. Se o animal não responder, ele está pronto para a cirurgia de perfusão.
   2. Colocar o animal anestesiado em decúbito dorsal na moldeira da cirurgia de perfusão e, com uma pequena tesoura de íris, fazer uma incisão na extremidade posterior do ventrículo esquerdo.
   3. Insira uma agulha de perfusão 22-G no ventrículo esquerdo e faça uma pequena incisão na aurícula direita para remover o fluido de perfusão do corpo. Use um sistema de perfusão alimentado por gravidade para permitir que o fluido de perfusão gelado (0,1 M PBS, pH 7,4) flua por 5 a 6 min (vazão de 20 a 25 ml / min).
      NOTA: A clear O fígado é o indicador de perfusão ideal.
   4. Mude a válvula tampão para uma solução gelada de paraformaldeído a 4% para fixação e deixe-a fluir por 8 a 10 min.
      NOTE:<span style='font-family:Arial,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > Tremor seguido de membros endurecidos ou rígidos é um indicador de boa fixação.
   5. Remova o cérebro do crânio usando uma tesoura. Usando uma espátula, colete o cérebro e coloque-o em um frasco de PFA a 4% (pelo menos 10x o volume do cérebro) e armazene a 4 ° C até uso posterior.

2. Processamento de tecidos

1. Corte as seções do criostato.
   1. Transfira o cérebro para soluções graduadas de sacarose (10%, 20% e 30%) e guarde a 4 °C por 24 h cada, até o uso.
   2. Usando um criostato a -22 °C, corte seções de 40 μm de espessura. Colete de 10 a 20 seções por poço em uma placa de 6 poços preenchida com PBS e azida de sódio (0,02%).

3. Colocalize cur(curcumin) com o Aβ anticorpo em placas Aβ e oligômeros.

1. Lave as seções do criostato da etapa 2.1.2 com PBS 3x em uma placa de 12 poços.
2. Bloqueie as seções com 10% de soro de cabra normal (NGS) dissolvido em PBS com 0,5% de Triton-X-100 em temperatura ambiente por 1 h.
3. Descarte a solução de bloqueio. Incubar as secções com anticorpos específicos para beta-amilóide (Aβ) (6E10 ou A11, diluído a 1:200) dissolvidos em solução de bloqueio fresca contendo 10% de NGS e 0,5% de Triton-X100 durante a noite a 4 °C num agitador a 150 rpm.
4. Descarte a solução de anticorpos e lave as seções com PBS 3x por 10 min cada.
5. Incube com a tag de anticorpo secundário com fluoróforo vermelho (por exemplo, Alexa
6. 594) por 1 h em temperatura ambiente no escuro.
7. Lave com PBS 3x por 10 min cada.
8. Lave com álcool 70% 1x.
9. Incube as seções com curcumina (Cur (10 μM)) por 5 min em temperatura ambiente.
10. Lave com álcool 70% 3x por 1 min cada.
11. Desidrate com álcool 90% e 100% por 1 min cada, limpe com xileno 2x por 5 min cada e monte em slides usando distyrene plasticizer xileno (DPX).
12. Visualize usando um microscópio de fluorescência com filtros de excitação/emissão apropriados para os sinais vermelho e verde.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Aanimal model of Alzheimer's	Laboratório de Jackson, Bar Harbor, ME
Absolute alcohol	VWR,Radnor, PA
Alexa 594	Santacruz Biotech, Dallas, TX
Antibody 6E10	Biolegend, San Diego, CA
Antibody A11	Millipore, Burlington, MA
Cryostat	GMI, Ramsey, MN	LeicaCM1800
Curcumin	Sigma, St. Louis, MO
Hidrogenofosfato dissódico	Sigma, St. Louis, MO
Plastificante de distireno xileno	BDH, Dawsonville, GA
Filter papers	Fisher scientific, Pittsburgh, PA
Microscópio fluorescente invertido	Leica, Buffalo Grove, IL	Leica DMI 6000B
Microscópio fluorescente invertido	Olympus, Shinjuku, Japão	Olympus 1x70
Normal goat serum	Sigma, St. Louis, MO
Paraformaldeído	Sigma, St. Louis, MO
Cloreto de potássio	Sigma, St. Louis, MO
Fosfato de di-hidrogênio de potássio	Sigma, St. Louis, MO
Azida de sódio	Sigma, St. Louis, MO
Sodium chloride	Sigma, St. Louis, MO
Sodium hydroxide	EMD Millipore, Burlington, MA
Pentobarbital de sódio	Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI
Triton-X-100	Sigma, St. Louis, MO
Xylene	VWR,Radnor, PA

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