Visualizando a atividade da proteína quinase A em um camundongo usando microscopia de imagem de fluorescência de dois fótons

Abstract

Fonte: Jongbloets, B. C., et al. Visualizando a atividade da proteína quinase A em camundongos com comportamento fixo na cabeça usando microscopia de imagem de fluorescência de dois fótons in vivo. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra um procedimento de microscopia de imagem de fluorescência de dois fótons para visualizar a atividade da proteína quinase A em camundongos com comportamento fixo na cabeça durante a locomoção forçada.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. In Vivo Microscopia de imagem vitalícia de fluorescência de dois fótons

1. Inicie a imagem de microscopia de imagem de fluorescência de dois fótons (2pFLIM) ou além de 2 semanas após a instalação da janela craniana. Minimize a interferência experimental devido ao estresse por meio do manuseio frequente e scruffing do camundongo antes do início do estudo de imagem para habituar o camundongo.
2. Defina o comprimento de onda do laser de excitação de dois fótons para 960 nm usando o software que controla o laser de dois fótons.
3. Anestesiar o camundongo com isoflurano a 4%. Confirme a anestesia adequada beliscando a cauda e observando as taxas de respiração. Ou seja, não deve haver resposta ao beliscão da cauda e a taxa de respiração deve ser reduzida para ~ 1 respiração por segundo. Para minimizar o tempo desnecessário do procedimento e como a anestesia dura apenas dois a três minutos, não são usados lubrificantes oculares.
4. Transfira o mouse anestesiado para a esteira motorizada (Figura 1C) e monte a placa de cabeça do mouse no suporte da placa de cabeça da configuração da esteira (consulte Figura 1 para detalhes). Limpe a superfície da lamínula da janela craniana do mouse com etanol a 70%.
5. Coloque a esteira motorizada com o mouse montado sob a objetiva 2pFLIM. Aplique uma gota de água destilada entre a lamínula da janela craniana e a objetiva.
6. Deixe o mouse montado acordar da anestesia e se acostumar com o ambiente da esteira e do microscópio por pelo menos 10 minutos. Monitore a frequência respiratória do mouse enquanto o mouse montado acorda da anestesia.
7. Navegue até o local de injeção sob epi-iluminação. Documente as características fiduciais (ou seja, vasos sanguíneos) sob campo claro para auxiliar na aquisição de imagens da mesma região de interesse (ROI) durante as sessões de imagem subsequentes.
8. Elimine qualquer luz recebida que não seja a luz emitida do tecido cerebral. Desligue a fonte de luz de epi-iluminação e feche o invólucro do equipamento 2pFLIM. Ative o 2pFLIM PMT ligando o comando de hardware voltage controle.
9. Adquira uma imagem z-stack 2pFLIM usando o software de aquisição 2pFLIM FLIMimage com as seguintes configurações recomendadas para imagens de somata tAKARα-positivo em camundongos acordados. Defina a média de quadros para 3 quadros, a velocidade de digitalização para 2 ms/linha, o tamanho da imagem para 128 x 128 pixels e o campo de visão para 90 a 100 μm. Ajuste as configurações de imagem com base na preparação e na configuração de hardware.
10. Inspecione a imagem adquirida na visualização FLIM (software personalizado desenvolvido internamente). Ajuste as configurações de imagem seguindo a etapa 1.9 para otimizar a contagem de fótons e minimizar o fotobranqueamento.

NOTA: Uma contagem de fótons integrada viável em um ROI para imagens ao longo da vida de um soma tAKARα-positivo in vivo é de ~1.000−10.000 fótons, dependendo da amplitude do sinal que resulta de um estímulo específico.

1. Use um campo de visão reduzido, velocidade de varredura reduzida, potência do laser aumentada e maior número de quadros a serem calculados para aumentar a contagem de fótons integrados e reduzir o erro de estimativa de tempo de vida. Ao mesmo tempo, certifique-se de usar a potência mínima essencial do laser, a média do quadro e a velocidade de digitalização para minimizar o fotobranqueamento.
2. Imagem em um intervalo de tempo regular (por exemplo, a cada 30−60 s) repetindo a aquisição da pilha z usando as configurações determinadas na etapa 1.10. Adquira imagens 2pFLIM de linha de base por pelo menos 15 minutos em velocidade zero na esteira
.
3. Defina a velocidade de rotação da esteira para ~15 cm/s por 15 min enquanto adquire imagens 2pFLIM. Continue a imagem por ≥20 min após desligar a rotação da esteira, para avaliar a duração da atividade da PKA após a cessação da locomoção forçada.
   

2. Análise de imagens 2pFLIM

1. Abra as imagens adquiridas no FLIMview e defina os seguintes parâmetros no FLIMview.

1. Clique nos campos de alcance mínimo e máximo de contagem de fótons únicos (SPC) no FLIMview. Insira o valor mínimo e máximo apropriado do intervalo de SPC, normalmente variando entre 1,2−2 e 10−12 ns, respectivamente.

2.₀ campo de valor no FLIMview e insira o t₀ valor (normalmente ~ 2 ns). Clique no campo de valor limite mínimo de luminância de tempo de vida no FLIMview e insira o valor limite desejado para 5−30 fótons.

2. Clique no botão do novo grupo (N) e atribua um nome de grupo experimental. Isso gerará um grupo que combina dados de cada imagem FLIM adicionada.

3. Clique no íconeROI botão no Roi Controls módulo do FLIMview e desenhe um ROI em torno de um soma tAKARα-positivo. Reduza o intervalo da pilha z, movendo o limite z inferior e superior no z-stack Control controles deslizantes no FLIMview, para minimizar a contaminação do sinal originado de fótons de fundo em outras profundidades z.

4. Clique no botão + para adicionar a imagem FLIM ao grupo (etapa 2.2). Clique no Calc botão para calcular o tempo de vida médio (LT, também chamado de tempo médio de emissão de fótons [MPET]), para o ROI e o erro de estimativa do tempo de vida (δτ).

5. Abra o próximo arquivo na série de imagens cronológicas 2pFLIM. Repita a etapa 2.4. Certifique-se de ajustar a posição do ROI e da faixa de pilha z para medir o mesmo soma tAKARα-positivo ao longo do tempo, porque pode haver desvio de tecido ao longo do tempo.

6. deltaMPET/MPET₀ no menu suspenso do Controles de grupo módulo. Clique no baseline# campo e insira os índices (por exemplo, 1 2 3 4 5 para as cinco primeiras imagens do grupo criado na etapa 2.3). Isso definirá a(s) imagem(ns) usada(s) para calcular o tempo de vida da linha de base (LT₀).

7. Clique em Plot para gerar um gráfico contendo a resposta FLIM (ΔLT/LT₀) de tAKARα durante o experimento nas ROIs definidas. Alterações normalizadas no tempo de vida (ΔLT) de ROIs individuais pelo tempo de vida da linha de base correspondente (LT₀) permitem a comparação da atividade de PKA durante a locomoção em diferentes ROIs.

Results

Materials