Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
Material cerebral arquivado fixado em paraformaldeído (PFA) infectado com RABV.
CUIDADO: Este protocolo usa várias substâncias tóxicas e/ou nocivas, incluindo PFA, metanol (MeOH), peróxido de hidrogênio (H2O2), azida de sódio (NaN3{TAG_38}}), tert{TAG_45}}-butanol (TBA), álcool benzílico (BA), benzoato de benzila (BB) e éter difenílico (DPE). MeOH e TBA são altamente inflamáveis. Evite a exposição usando equipamento de proteção individual adequado (jaleco, luvas e proteção para os olhos) e realizando experimentos em um exaustor. Colete os resíduos separadamente em recipientes apropriados e descarte-os de acordo com os regulamentos locais. O vírus da raiva é classificado como um patógeno de nível de biossegurança (BSL)-2 e, portanto, geralmente pode ser manipulado em condições BSL-2. Algumas atividades, incluindo procedimentos que podem gerar aerossóis, trabalhar com altas concentrações de vírus ou trabalhar com novos lyssavirus, podem exigir a classificação BSL-3. A profilaxia pré-exposição é recomendada para profissionais de alto risco, incluindo cuidadores de animais e trabalhadores de laboratório. Consulte os regulamentos das autoridades locais.
1. Fixação do tecido cerebral e seccionamento
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Fixe as amostras cerebrais em um volume apropriado de 4% de PFA em solução salina tamponada com fosfato (PBS [pH 7,4]) por pelo menos 48 h a 4 ° C (com uma proporção aproximada de tecido para fixador de 1:10 [v / v]). Lave as amostras de tecido 3x em PBS por pelo menos 30 min a cada lavagem e armazene-as em 0,02% NaN3/PBS a 4 °C até o uso. Corte o tecido em seções de 1 mm de espessura usando um vibratomo (taxa de alimentação da lâmina: 0,3–0,5 mm/s, amplitude: 1 mm, espessura do corte: 1.000 μm). Para manter a sequência de corte correta, armazene cada seção de tecido separadamente em um poço de uma placa de cultura de células multipoços. Adicione 0,02% de NaN3/PBS e armazene as seções de tecido a 4 °C até o uso. 2. Pré-tratamento da amostra com metanol
NOTA: Execute todas as etapas de incubação com oscilação suave e, se não indicado de outra forma, à temperatura ambiente. Proteja as amostras da luz. O pré-tratamento da amostra serve ao propósito geral de melhorar a difusão de anticorpos e reduzir a autofluorescência tecidual por exposição a MeOH e H2O2, respectivamente.
- Prepare soluções de MeOH a 20% (v/v), 40%, 60% e 80% em água destilada. Por exemplo, para 20% de MeOH, adicione 10 mL de 100% de MeOH a 40 mL de água destilada em um recipiente selável apropriado e misture invertendo-o.
- Transfira as amostras para recipientes de tamanho razoável (por exemplo, tubos de reação de 5 mL). Tome cuidado para usar materiais quimicamente resistentes aos reagentes usados neste protocolo. Por exemplo, observe que, embora o polipropileno seja adequado, o poliestireno não é.
NOTA: As especificações de volume neste protocolo referem-se a tubos de reação de 5 mL. Se for utilizado um recipiente diferente, ajustar os volumes em conformidade. - Incubar as amostras em 4 mL de cada concentração da série preparada de soluções de MeOH em ordem crescente por 1 h cada.
- Incubar as amostras 2x por 1 h cada em MeOH puro (100%).
- Resfrie as amostras a 4 ° C (por exemplo, em uma geladeira própria para laboratório).
- Prepare a solução clareadora (5% de H2O{TAG_175}}2} em MeOH) diluindo, por exemplo, uma solução estoque de 30% de H2O2 MeOH puro (100%) e resfrie a 4 °C.
- Remova o MeOH 100% das amostras refrigeradas e adicione 4 mL de solução clareadora pré-resfriada (5% H2O2{TAG_208}} em MeOH). Incubar durante a noite a 4 °C.
- Troque a solução clareadora por 4 mL de MeOH a 80% e incube por 1 h. Continue usando a série preparada de soluções de MeOH em ordem decrescente por 1 h cada até que as amostras tenham sido incubadas por 1 h em 4 mL de 20% de MeOH.
- Lave as amostras 1x por 1 h com 4 mL de PBS.
3. Imunocoloração{TAG_233}}
NOTA: Execute todas as etapas de incubação com oscilação suave e, se não indicado de outra forma, à temperatura ambiente. Proteja as amostras da luz. Para evitar o crescimento microbiano, adicione NaN3 a uma concentração final de 0,02% às soluções desta seção. As amostras de tecido são ainda permeabilizadas pelo tratamento com detergentes não iônicos Triton X-100 e Tween 20. O soro normal é usado para bloquear a ligação inespecífica de anticorpos. Glicina e heparina são adicionadas para reduzir o fundo de imunomarcação.
- Lave as amostras 2x por 1 h cada em 4 mL de Triton X-100/PBS a 0,2%.
- Permeabilize as amostras por 2 dias a 37 °C com 4 mL de Triton X-100/20% de dimetilsulfóxido (DMSO)/0,3 M de glicina/PBS.
- Bloqueie a ligação inespecífica de anticorpos incubando as amostras por 2 dias a 37 ° C em 4 mL de Triton X-100 / 10% DMSO a 0,2% / soro normal a 6% / PBS.
NOTA: Use soro normal da mesma espécie em que o anticorpo secundário foi criado para obter resultados de bloqueio ideais. - Incubar as amostras em 2 ml de solução de anticorpos primários (3% de soro normal/5% de DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 com heparina] + anticorpos/anticorpos primários) durante 5 dias a 37 °C. Renovar a solução de anticorpos primários após 2,5 dias.
- Para PTwH, reconstituir o sal de heparina sódica em água destilada para fazer uma solução-mãe de 10 mg/ml (conservar esta solução, alíquota, a 4 °C). Adicione a solução estoque a 0,2% Tween 20 / PBS a uma concentração final de 10 μg / mL.
NOTA: A escolha da diluição correta do anticorpo pode exigir otimização. Geralmente, as concentrações imuno-histoquímicas padrão são um bom ponto de partida.
- Lave as amostras por 1 dia em 4 mL de PTwH, trocando o tampão de lavagem pelo menos 4x–5x durante o dia e deixando a lavagem final durante a noite.
- Incubar as amostras em 2 ml de solução de anticorpos secundários (soro normal a 3% / PTwH + anticorpos secundários / anticorpos) durante 5 dias a 37 °C. Actualizar a solução de anticorpos secundários após 2,5 dias.
- Dilua o(s) anticorpo(s) secundário(s) a 1:500 em solução de anticorpos secundários (ou seja, 4 μL em 2 ml).
- Lave as amostras por 1 dia conforme descrito na etapa 3.5, deixando a lavagem final durante a noite.
4. Coloração nuclear{TAG_335}}
NOTA: Execute todas as etapas de incubação com oscilação suave e, se não indicado de outra forma, à temperatura ambiente. Proteja as amostras da luz. Se nenhuma coloração nuclear for necessária ou o comprimento de onda de excitação/espectro de emissão do vermelho de tiazol (TO-PRO-3) for necessário para a excitação ou detecção de outro fluoróforo, pule esta etapa.
- Dilua a coloração de ácido nucleico TO-PRO-3 a 1:1.000 em PTwH e incube as amostras em 4 mL de solução de coloração nuclear por 5 h.
- Lave as amostras por 1 dia, conforme descrito na etapa 3.5, deixando a lavagem final durante a noite.
NOTA: Após as lavagens, as amostras podem ser armazenadas em PBS a 4 °C até a limpeza óptica.
5. Limpeza do tecido
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NOTA: Execute todas as etapas de incubação com oscilação suave e, se não indicado de outra forma, à temperatura ambiente. Proteja as amostras da luz. As amostras de tecido são desidratadas em uma série graduada de soluções TBA. Como a imunocoloração requer soluções aquosas, todos os procedimentos de coloração devem ser concluídos antes da limpeza do tecido. A depuração óptica e a correspondência do índice de refração são obtidas pelo tratamento com uma mistura de BA, BB e DPE. A solução de limpeza é suplementada com DL-α-tocoferol como antioxidante. - Prepare soluções TBA a 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90% e 96% TBA em água destilada. Por exemplo, para 30% de TBA, adicione 15 mL de 100% de TBA a 35 mL de água destilada em um recipiente selável apropriado e misture invertendo.
NOTA: TBA tem um ponto de fusão de 25–26 °C; assim, tende a ser sólido à temperatura ambiente. Para preparar soluções TBA, aqueça o frasco bem fechado a 37 °C em uma incubadora ou banho-maria. - Desidratar as amostras com 4 ml de cada concentração da série preparada de soluções TBA por ordem crescente durante 2 h cada. Deixe o 96% TBA durante a noite.
- Desidratar as amostras em TBA puro (100%) durante 2 h.
- Preparar a solução de limpeza BABB-D15.
NOTA: BABB-D15 é uma combinação de BA e BB (BABB) que é misturada com DPE na proporção de x:1, onde x é especificado no nome da solução, neste caso 15. - Para BABB, misture uma parte de BA com duas partes de BB.
- Misture BABB e DPE na proporção de 15:1.
- Adicione 0,4 vol% de DL-α-tocoferol (vitamina E).
NOTA: Por example, para 20 mL de BABB-D15, misture 6.25 mL de BA com 12.5 mL de BB. Adicione 1,25 mL de DPE e complemente-o com 0,08 mL de DL-α-tocoferol.
- Limpe as amostras na solução de limpeza até que fiquem opticamente transparentes (2–6 h).
- As amostras podem ser armazenadas a 4 °C em BABB-D15, protegidas da luz, até à montagem e obtenção de imagens.
6. Montagem de amostras
- Usando uma impressora 3D, imprima a câmara de imagem e a tampa (material: copoliéster [CPE], bico: 0,25 mm, altura da camada: 0,06 mm, espessura da parede: 0,88 mm, contagem de parede: 4, preenchimento: 100%, sem estrutura de suporte).
- Monte a câmara de imagem (Figura 1).
- Monte uma lamínula redonda (diâmetro: 30 mm) na câmara de imagem com borracha de silicone RTV-1 (vulcanização à temperatura ambiente de um componente). Remova o excesso de borracha de silicone com um cotonete umedecido com água e catalise durante a noite.
- Monte uma lamínula redonda (diâmetro: 22 mm) na tampa com borracha de silicone RTV-1. Remova o excesso de borracha de silicone com um cotonete umedecido com água e catalise durante a noite.
- Coloque a amostra em uma câmara de imagem, adicione um pequeno volume de BABB-D15 e insira a tampa. Encha a câmara com BABB-D15 através da entrada, usando uma agulha hipodérmica (27 G x 3/4 de polegada [0.40 mm x 20 mm]).
- Conecte a entrada e sele a câmara de imagem com borracha de silicone RTV-1. Cure durante a noite no escuro.
7. Imagem e processamento de imagem
- Configure a aquisição de imagem selecionando as respectivas linhas de laser para corresponder aos fluoróforos usados. Ajuste as faixas de detecção de cada detector para evitar a sobreposição de sinal entre os canais.
NOTA: As faixas de detecção exemplares para Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 e TO-PRO-3 são de 500 a 550 nm, 590 a 620 nm e 645 a 700 nm, respectivamente. - Escolha os parâmetros de aquisição, defina a borda superior e inferior da pilha z e adquira a pilha de imagens.
NOTA: Os parâmetros de aquisição exemplares são uma varredura sequencial com um tamanho de pixel de 60-90 nm, um tamanho de passo z de 0,5 μm, uma média de linha de 1, uma velocidade de varredura de 400 Hz e um tamanho de orifício de 1 unidade Airy. - Processe a pilha de imagens usando o software de análise de imagem apropriado (por exemplo, Fiji) para gerar projeções 3D ou realizar análises aprofundadas.
NOTA: Devido ao grande tamanho dos arquivos de imagem adquiridos, geralmente é necessário o uso de uma estação de trabalho. - Abra o(s) arquivo(s) de aquisição ou de imagem em Fiji (Arquivo |{ {TAG_589}} Abrir | Selecione os arquivos).
- Se estiver usando, por exemplo, arquivos LIF, marque ou desmarque as opções desejadas na janela de diálogo Bioformatos. Visualize a pilha com Hyperstack. Fora isso, nenhuma seleção ou ticks específicos são necessários. Pressione OK.
- Se o arquivo contiver várias pilhas de imagens, selecione as que serão analisadas e confirme pressionando OK.
- Execute a correção de branqueamento dividindo a imagem mesclada em canais individuais (Imagem |{ {TAG_645}} Cor | Ferramenta Canais e selecione Mais | Dividir canais). Para cada canal, selecione correção de branqueamento (Imagem | {TAG_676}}Ajuste | Correção de branqueamento ) e escolha Proporção simples (intensidade de fundo: 0.0).
NOTA: Em alguns casos, por exemplo, quando não há decaimento linear do sinal ou o sinal é muito fraco no geral, Razão Simples pode falhar. Como alternativa, tente Ajuste exponencial ou pule a correção de alvejante. - Ajuste o brilho e o contraste de cada canal usando os controles deslizantes (Imagem |{ {TAG_724}} Ajuste | Brilho | Contraste).
- Mesclar os canais (Imagem {TAG_753}}|{ {TAG_754}} Cor | Mesclar canais), faça um composto (}Imagem | Cor | Ferramenta de canais, em seguida, selecione Mais | Faça o Composite) e converta-o para o formato RGB (Imagem | Cor | Canais Ferramenta e selecione Mais | Converter para RGB).
- Se necessário, redimensione a pilha de imagens para reduzir o tempo de computação e o tamanho do arquivo (Imagem | Ajuste | Tamanho, ambas as opções marcadas mais interpolação bilinear).
- Gerar uma projeção 3D (Imagem | Pilhas | Projeto 3D). Escolha Ponto mais brilhante como um método de projeção e defina o espaçamento entre fatias para corresponder ao tamanho da etapa z da pilha de imagens adquirida. Para obter a máxima qualidade, defina o incremento do ângulo de rotação como 1 e ative a interpolação. Modifique a rotação total, os limites de transparência e a opacidade conforme necessário.
- Se necessário, reajuste o contraste e o brilho convertendo a projeção 3D de volta para o formato de 8 bits (Imagem | Tipo | }8 bits{TAG_909}}). Use os respectivos controles deslizantes (Imagem | Ajuste | Brilho | Contraste) e reconverta a pilha de imagens para o formato RGB conforme descrito na etapa 7.3.4.
- Salve a projeção 3D como . TIF (formato de arquivo de imagem) e arquivo .AVI (formato de arquivo de vídeo).
