Usando reflectometria espectral para determinar diâmetros de axônio mielinizados em uma fatia de cérebro de camundongo fixa

Resumo

Fonte: Kwon, J., et al., Microscopia Reflectométrica Espectral em Axônios Mielinizados In Situ. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o uso da reflectometria espectral com um microscópio confocal hiperespectral para analisar padrões de interferência e determinar diâmetros de axônios mielinizados em fatias fixas de tecido cerebral.

Protocolo

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p style='line-height:1.7999999999999999999;margin-bottom:0pt;margin-top:12pt;' dir='ltr'>Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pela revisão ética animal apropriada comitê.

1. Calibration

1. Ligue o microscópio pelo menos 1 h antes da imagem para permitir a estabilização térmica da fonte de laser (consulte a Tabela de Materiais). Em seguida, ligue o software para varredura espectral (consulte Tabela de materiais) e clique no botão Adquirir na parte superior da GUI (interface gráfica do usuário) (Figura 1a).
2. Ligue o obturador do software para o laser de luz branca (WLL) e o tubo fotomultiplicador (PMT) (Figura 1a).
3. Selecione o modo xyΛ na lista suspensa no Modo de Aquisição e, em seguida, o modo de entrada do laser é alterado automaticamente de Porcentagem constante para Potência constante. Desmarque a caixa de seleção Movimento automático da controladora de armazenamento. Em seguida, defina a janela espectral do laser de entrada para 470–670 nm e o tamanho do passo espectral para 4 nm em Λ-Excitation Lambda Scan Settings (Figura 1b).
4. DEFINA a faixa espectral de PMT para 450-690nm clicando duas vezes ou movendo a barra de ajuste para a faixa espectral (Figura 1c).
   Nota: <span style='font-family:Arial,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' >Essa faixa espectral deve incluir a largura de banda completa da fonte de entrada.
5. Selecione uma lente objetiva de imersão em água, adequadamente com uma abertura numérica alta (NA > 0,7) e dê qualquer valor ao PMT e à potência do laser para ativar o AOBS (Acousto-optic beam splitter) e botão Live Scan. Alterne o caminho óptico verificando o reflexo na configuração AOBS (Figura 1d).
6. Monte um espelho de referência (consulte a Tabela de Materiais) na platina do microscópio. A superfície do espelho deve estar voltada para a lente objetiva. Se não for fácil montar o espelho na platina do microscópio, cole um espelho em uma placa plana (e.g., slide vidro).
7. Controle a platina do microscópio para alinhar o plano focal com a superfície do espelho.
8. Ajuste o ganho PMT e a potência do laser, considerando a faixa dinâmica do detector e, em seguida, altere o modo de entrada do laser de Porcentagem Constante para Potência Constante.
   Nota:<span style='font-family:Arial,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > Como é típico, um ganho PMT de 500 (V) e uma potência relativa do laser de 0,1% são usados a 570 nm.
9. Confirme em um modo de pseudo-cor para verificar se não há saturação em toda a faixa de comprimento de onda. Se for observada saturação, diminua a potência do laser (Figura 1a).
10. Execute a aquisição do Lambda Scan.
11. Remova o espelho do palco e repita a mesma aquisição sem uma amostra para obter a referência escura (i.e., deslocamento escuro).
12. Salve os dados em um formato TIF multiempilhado.

2. SpeRe (Reflectometria espectral) Aquisição de imagem

1. Coloque o tecido montado no microscópio stage. Para alinhar aproximadamente o tecido ao plano focal da lente objetiva, use o modo de fluorescência de campo amplo através de uma ocular.
2. Com o Live Scan ligado, controle a platina do microscópio para alinhar o plano focal à região de interesse no tecido. Para evitar o ruído de fundo da lamínula, selecione a região alvo de pelo menos 15 μm de profundidade da interface vidro-tecido.
3. Adquira a pilha de imagens espectrais para a região de destino usando o mesmo procedimento descrito nas etapas 1.1 a 1.10.
4. Salve os dados para o tecido e o deslocamento escuro em um Multistacked TIF formato.
   Nota: O O experimentador pode fazer uma pausa nesta fase.

3. Processamento e análise de imagens

1. Abra os dados espectrais (TIF multi-empilhado) para o espelho de referência e o tecido cerebral no ImageJ.
2. Selecione as ROIs (regiões de interesse) para as pilhas de imagens abertas - a área central para o espelho de referência e o segmento de uma fibra axônica para o tecido cerebral.
3. Adquira os espectros brutos para os ROIs selecionados executando Image → Stacks → Plotar perfil do eixo Z no menu ImageJ.
4. Abra os dados de deslocamento escuro, um tomado para o espelho de referência e o outro para o tecido cerebral.
5. Adquira os espectros para os deslocamentos escuros executando Image → Stacks → Plotar perfil do eixo Z no menu ImageJ.
6. Salve todos os espectros adquiridos usando o Copiar e colar opções.
   Nota:<span style='font-family:Arial,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > Para imagens SpeRe, recomenda-se o uso do campo de imagem central para minimizar as aberrações ópticas fora do eixo. As fibras axonais podem ser estruturalmente heterogêneas ao longo de seu comprimento. Portanto, recomenda-se selecionar o ROI em um pequeno segmento de axônio, normalmente < 5 μm, para minimizar o artefato de volume parcial.

Resultados

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Objetivo apocromático 40×, NA 1.1	Leica Microsystems	15506357	Water-immersion type.
Fluoromyelin Green	Thermo Fisher	F34651
Leica SP8 TCS microscope	Leica Microsystems	SP8
Imaging software	Leica Microsystems	LAS-X
Matlab	MathWorks
Mirror	Thorlabs	PF10-03-P01	Revestido com prata protegida.
Cover slip	Thermo Fisher	3306	Espessura: #1 (0,13 a 0,17 mm).
Slide glass	Muto Pure Chemicals	5116-20F	Espessura: ~1 mm.
Super glue	Henkel	Loctite 406	Use um equipamento dispensador para evitar contato com a pele ou os olhos.
White-light laser	NKT photonics	EXB-6	EXB-6 foi descontinuado e substituído por EXU-6.