Visualização de projeções de neurônios motores e ramificação de axônios usando microscopia de fluorescência de folha de luz

Resumo

Source: Liau, E. S. et al. Visualização da navegação do axônio motor e quantificação da arborização do axônio em embriões de camundongo usando microscopia de fluorescência de folha de luz. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra o uso de microscopia de fluorescência de folha de luz para obter imagens de projeções de neurônios motores e ramificação de axônios em embriões de camundongos transgênicos. Ele descreve as etapas envolvidas na preparação da amostra, imagem e reconstrução 3D da ramificação axonal para avaliar o crescimento e a conectividade do neurônio motor.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pela ética animal apropriada comitê de revisão.

1. Microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) (2–3 h)

1. Sample set-up
   1. Configure a óptica de iluminação 5X/0.1 e a óptica de detecção 5X/0.16. Monte o porta-amostras e o capilar da amostra (1,5 mm de diâmetro interno, verde) e coloque-os no microscópio.
      NOTE: Consulte o Manual de Operação do microscópio para obter procedimentos de configuração detalhados.
   2. Monte o embrião da seguinte forma:
      1. Prepare a ponta da pipeta P200 cortando a parte superior de modo que ela se ajuste ao diâmetro do capilar e remova a parte pontiaguda (~ 3 mm) para o sample fixação.
      2. Derreta a extremidade embotada da ponta da pipeta usando uma pequena chama.
      3. Apague a chama e prenda rapidamente o embrião verticalmente na extremidade derretida.
      4. Encaixe a parte superior da ponta da pipeta com o sample capilar.
   3. Deixe o tampão da câmara se equilibrar com o embrião por 1 min para limpar detritos ou bolhas.
   4. Usando o software de imagem, selecione Locate capillary sob o Localize tab e ajuste os eixos x, y e z para posicionar o capilar de amostra.
   5. Selecione Locate sample e amplie para 0,6X para focar no embrião. Gire o embrião para garantir que o eixo longo do membro da imagem esteja alinhado com o caminho de luz das duas fontes de luz (Figura 1B).
2. Aquisição de imagem
   1. Under the Aquisição tab, define os parâmetros do caminho da luz, como objetivos de detecção, filtro de bloqueio de laser, divisor de feixe, câmeras e lasers.
      NOTE: O canal de proteína fluorescente verde (GFP) é usado neste experimento (comprimento de onda de excitação: 488 nm; filtro de emissão: passa-banda (BP) 505 a 545 nm; divisor de feixe: SPS LP 560).
   2. Marque a caixa de seleção de varredura dinâmica para redução de sombra.
   3. Defina as configurações de aquisição: profundidade de bits, 16 bits; zoom, 0,36-0,7X; iluminação de um lado (esquerda/direita) ou iluminação de dois lados.
   4. Clique em Continuous e defina a intensidade do laser, o tempo de exposição, a potência do laser e a posição da folha de luz para adquirir imagens mais nítidas.
      NOTE: A potência do laser é mantida o mais baixa possível para minimizar os danos fotográficos.
   5. Pressione STOP para encerrar a aquisição da imagem.
3. Aquisição multidimensional
   1. Defina a pilha z movendo a posição Z para a primeira e a última imagem. Clique em Optimal para definir o número da fatia.
   2. Clique em Start Experiment<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-align:pre-wrap;'> para adquirir a pilha z selecionada.
   3. Quando terminar, salve a imagem no formato .czi.
4. Processamento de imagem (opcional)
   1. Prossiga com Fusão de dois lados sob o Lightsheet Processing canal se a iluminação do lado duplo for aplicada. Processamento multivisualização é necessário se várias visualizações forem adquiridas para combinar imagens de vários ângulos.
   2. Crie uma imagem 2D usando dados dos pixels de maior intensidade ao longo do eixo de projeção sob o Maximum Intensity Projection canal.
   3. Sob o Copy canal, clique em Subset para selecionar subconjuntos de imagens do conjunto original.

2. quantificação da arborização do axônio (30 min para cada nervo individual)

1. Abra o arquivo de imagem no software de análise de imagem (por padrão, a imagem que contém os dados XYZ é aberta no modo Superar e como uma visualização renderizada em 3D).
2. Ajuste a cor, o brilho e o contraste da imagem usando o Display Adjustmentjanela (Edit | Mostrar ajuste de exibição) para detectar filamentos com base no contraste de intensidade local.
3. Clique no Add New Filaments ícone e selecione o ícone Autopath (no loop) algoritmo no menu suspenso.
4. Selecione a região de interesse (neste caso, o axônio de segmentação de interesse). Clique em Next quando terminar.
5. Defina os pontos inicial e inicial atribuindo as medidas de diâmetro maior e mais finas, que podem ser medidas usando o Slice modo.
6. Atribua um ponto de partida na borda da região de interesse. Para obter a adição ou remoção manual de pontos de partida, primeiro altere o modo de ponteiro (Navigate | Selecione) e, em seguida, Shift + clique com o botão direito do mouse nos pontos de interesse.
7. Selecione limites manuais para pontos de semente para garantir que toda a arborização visível seja marcada. Altere o modo do ponteiro (Navigate | Selecione) e, em seguida, Shift + clique com o botão esquerdo nos pontos de interesse para adicionar ou remover manualmente os pontos de semente.
   NOTE: É importante remover manualmente os ruídos de fundo e os sinais dos nervos vizinhos.
8. Marque a caixa Remove seed points around starting points.
9. Verifique Remover segmentos desconectados permitir a exclusão de pontos muito distantes e que possam representar ruído de fundo. Indique o Maximum Gap Length na próxima etapa para definir o limite superior para exclusão.
10. Ajuste o limite para subtração de fundo, que usa um filtro gaussiano para estimar a intensidade de fundo de cada voxel.
11. Defina o limite automático para o diâmetro do dendrito usando o Área aproximada da seção transversal algoritmo.
12. Pule as etapas para o cálculo da lombada.
13. Finalize o processo e escolha o estilo e a cor desejados.
14. Desmarque a caixa de volume em Properties para visualizar apenas os axônios reconstruídos.
15. Sob o Statistics tab, selecione Detailed. Use Filament No. Dendrite Terminal Points para quantificar os terminais nervosos motores como um indicador de arborização do axônio motor.
    NOTA: Estatístico pode ser adicionada, se desejado.
16. Exporte a imagem do axônio reconstruído como um arquivo .tif.

Resultados

Materiais