Imagem histoquímica de módulos corticais em seções cerebrais achatadas

Resumo

Source: <a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/56992/ visualização-de-módulos-corticais-em-córtices-de-mamíferos-achatados'>Lauer, S. M., et al. Visualização de módulos corticais em córtices de mamíferos achatados. J. Vis. Exp. (2018)
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p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;text-align:justify;' dir='ltr'>Este vídeo demonstra um método para visualizar os módulos corticais em seções cerebrais achatadas usando coloração histoquímica. As seções pré-fixadas são tratadas com um reagente de tensão que destaca os aglomerados neurais ativos, formando regiões escuras e de alto contraste. Após a montagem e desidratação, os módulos corticais aparecem sob um microscópio de campo claro como padrões escuros e irregulares.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Visualização de módulos corticais usando coloração de citocromo oxidase

OBSERVAÇÃO: Diferentes protocolos de coloração foram desenvolvidos para detecção histoquímica da atividade da citocromo oxidase. Este protocolo utiliza sulfato de níquel-amônio (NiAS), resultando em maior contraste e módulos mais bem definidos nas áreas corticais coradas.

1. Prepare a solução de coloração citocromo oxidase. Para 10 mL de solução, adicione 10 mL de tampão de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) (0,1 M, pH 7,4), 400 mg de sacarose, 12,5 mg de NiAS, 2 mg de citocromo C e 6 mg de diaminobenzidina (DAB).
   CUIDADO: DAB e NiAS são cancerígenos.
   NOTA: Adicione DAB pouco antes da incubação das seções.
2. Lave as seções em tampão HEPES (0,1 M, pH 7,4) em uma coqueteleira por 15 min.
3. Incube as seções na solução de coloração à temperatura ambiente em um agitador.
   NOTA: Observe a velocidade da coloração. Se não houver reação visível, mude para incubação a 37 °C. Dependendo da quantidade de fixação, a coloração pode ser observada após 10 minutos ou em várias horas.
4. Pare a reação adicionando 4% de paraformaldeído (PFA); Isso evita a re-morte indesejada e um aumento do sinal de fundo.
5. Lave as seções três vezes usando o tampão HEPES por 10 min.
6. Monte e seque as seções em lâminas de vidro.
7. Desidrate as seções com um álcool crescente row:
   1. Lave as lâminas em etanol a 60% por 1 min. Lave as lâminas em etanol a 80% por 1 min. Lave as lâminas em etanol a 96% por 2 min. Lave as lâminas em etanol a 100% por 3 min. Lave as lâminas em isopropanol por 5 min. Lave as lâminas em xileno por 5 min.
8. Adicione imediatamente um meio de montagem de endurecimento rápido e adicione uma lamínula. Critical: Não use suportes de montagem à base de água, pois o NiAS será lavado e degradará a mancha.
9. Mantenha as seções a 4 ° C para armazenamento de longo prazo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Coloração de citocromo oxidase
	Sigma-Aldrich	D5637
HEPES	Carl Roth	9105.4
Meios
Eukitt (histoquímica)	Sigma-Aldrich	3989
Desidratação
Etanol 100%	Carl Roth	9065.3
Etanol 96%	Carl Roth	P075.3
2-Propanol	Carl Roth	6752.4
Substituto de xileno	Fluka	78475
Dispositivos/ferramentas
Dumont 55 Fórceps - Inox	Fine Science Tools	11255-20
Dumont 5 Fórceps - Inox Biology Tip	Fine Science Tools	11252-30
Dumont 5SF Fórceps - Inox Super Fine Tip	Fine Science Tools	11252-00

Citocromo c do coração equino Sigma-Aldrich C2506 3,3'Diaminobenzidina tetracloridrato hidrato de montagem ou congelamentoalcoólica