Este vídeo demonstra o uso da citometria de fluxo para analisar células imunes em nervos ciáticos de camundongos e gânglios da raiz dorsal (DRGs). O processo envolve a marcação de células imunes com anticorpos marcados com fluoróforo e biotina, estabilizando e permeabilizando as células e usando marcadores fluorescentes para detectar características nucleares e de superfície celular. A técnica permite uma avaliação quantitativa da heterogeneidade das células imunes nos tecidos nervosos.
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Artigo de método
Análise de células imunes em tecidos nervosos de camundongos usando citometria de fluxo
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29 de maio de 2025
Neste artigo
Resumo
Protocolo
Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Digestão do Nervo Ciático e DRG
- Prepare os meios de digestão (Meio de Eagle Modificado de Dulbecco [DMEM], ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico 10 mM [HEPES], 5 mg/mL de albumina sérica bovina [BSA], 1,6 mg/mL de colagenase Tipo 4) suplementado com 100 μg/mL de desoxirribonuclease e armazene em gelo.
NOTE: A quantidade de meio de digestão necessária por camundongo (nervos ciáticos + DRGs) é de 1 mL. Uma vez preparadas, as alíquotas dos meios de digestão podem ser armazenadas a -20 °C. - Transfira os nervos ciáticos e DRGs de um camundongo para tubos separados de 1,5 mL contendo 500 μL de meio de digestão. Para os nervos ciáticos, corte o material em 15-20 pedaços usando uma tesoura de mola e, em seguida, incube as suspensões de tecido em uma incubadora agitada a 37 ° C por 20 min com agitação suave (≤ 450 rpm).
- Triturar repetidamente a suspensão celular através da ponta da pipeta de 1.000 μL para dissociar mecanicamente qualquer tecido incompletamente digerido.
NOTE: Se a suspensão for difícil de titular, corte a ponta da pipeta com uma tesoura para criar uma extremidade romba. Incubar a suspensão de tecido a 37 °C durante 20 min com agitação suave (≤ 450 rpm). - Repita a trituração através de uma ponta de pipeta de 1.000 μL e incube por mais 10 min a 37 °C com agitação suave (≤ 450 rpm).
- Prepare o tampão FACS (solução salina tamponada com fosfato [PBS] suplementada com 10% de soro fetal de bezerro [FCS] e 1 mM de ácido etilenodiamina tetracético [EDTA]) e armazene no gelo. Enxaguar e embeber uma tela de aço inoxidável com uma malhagem de 140 μm com tampão de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) em placa de Petri de 60 x 15 mm sobre gelo.
NOTE: Os filtros de tela de nylon devem ser evitados, pois levam a uma perda significativa no rendimento de células nucleadas. - Passe repetidamente as suspensões de tecido através do filtro de tela de 140 μm, enquanto ele é mantido sobre a placa de Petri, com pinça romba, no gelo. Recolha a suspensão celular da placa de Petri e transfira-a para um novo tubo de 1,5 ml armazenado em gelo.
- Empurre qualquer tecido incompletamente digerido que permaneça no filtro por trituração repetida com uma ponta de pipeta de 1.000 μL. Enxágue o filtro de tela duas vezes com 500 μL de tampão FACS e colete a suspensão celular resultante na placa de Petri para combinar com a suspensão celular da etapa 1.6.
NOTE: Se o citómetro de fluxo utilizado for sensível a detritos, a suspensão celular do passo 1.7 pode ser passada através de um filtro de ecrã de 70 μm; no entanto, isso pode levar a uma perda no rendimento das células nucleadas. - Centrifugue as suspensões celulares a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Elimine o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular em 1 ml de tampão FACS. Repita esta etapa de lavagem uma vez.
- Ressuspenda o pellet celular em 150-350 μL de tampão FACS, dependendo do número de colorações necessárias (150 μL de tampão FACS por painel de coloração).
2. Coloração do Nervo Ciático e DRG com Anticorpos Marcados com Fluorescência para Citometria de Fluxo
- Transfira 100 μL do nervo ciático ou suspensão de células DRG para um poço em forma de V em uma placa de 96 poços no gelo.
NOTE: As células de coloração simples são necessárias para todos os anticorpos usados, pois fornecerão os controles necessários para configurar a citometria de fluxo em relação aos ganhos e compensação de tensão do tubo fotomultiplicador (PMT), bem como para ajudar a distinguir a ligação específica da não específica. - Agrupe as suspensões de células restantes (aproximadamente 50 μL por amostra) dos nervos ciáticos ou amostras de DRG, para servir como um controle não corado.
- Centrifugue a placa a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Elimine o sobrenadante invertendo a placa sobre um recipiente e aplicando um movimento brusco do pulso e seque suavemente em papel toalha.
- Para coloração superficial, ressuspenda cada um dos grânulos celulares em 20 μL de tampão FACS contendo os anticorpos de interesse (CD45-A647, CD11b-PerCP / Cy5.5 e complexo principal de histocompatibilidade [MHC] Classe II-Biotina) e incube, protegido da luz, em gelo por 30 min.
NOTE: (1) A diluição ideal de anticorpos deve ser determinada antes da utilização, realizando uma série de diluições de acordo com as informações do fabricante sobre o produto; (2) A coloração inespecífica pode ser reduzida por incubação com bloco Fc nesta etapa, de acordo com as instruções do fabricante; e (3) A coloração de controle de isotipo geralmente não é necessária ao usar anticorpos primários diretamente conjugados com um fluoróforo e/ou quando o(s) antígeno(s) de interesse produz(em) populações distintas. - Adicionar 130 μL de tampão FACS a cada alvéolo e centrifugar a placa a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante conforme descrito anteriormente (passo 2.3) e lavar os sedimentos das células duas vezes com 150 μL de tampão FACS.
NOTA: Se estiver usando um anticorpo primário não conjugado ou um anticorpo primário conjugado à biotina, um reagente secundário apropriado, conjugado a um fluoróforo, pode ser adicionado neste ponto e as etapas 2.4-2.5 são repetidas. No caso deste protocolo, estreptavidina-PE/Cy7 ou estreptavidina-PerCP foi utilizada para detectar MHC Classe II em combinação com CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5, ou em combinação com CD68-APC e F4/80-PE/Cy7, respectivamente. - Para fixação, após a última etapa de lavagem, ressuspenda os grânulos celulares em 100 μL de paraformaldeído a 4% em PBS (pH 7,4). Incubar a placa no gelo durante 10 min e depois centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante conforme descrito anteriormente (passo 2.3) e lavar os grânulos das células uma vez com 150 μL de tampão FACS.
Cuidado: O paraformaldeído é tóxico; use proteção adequada, como luvas e óculos, etc.
NOTA: Ressuspenda os pellets celulares em 150 μL de tampão FACS e armazene protegido da luz, a 4° C por até dois dias. Se não for necessária qualquer coloração intracelular, avançar para o passo 2.11 depois de centrifugar a placa a 400 x g durante 5 min a 4 °C. - Para coloração intracelular, ressuspenda os grânulos celulares em 150 μL de tampão FACS + 0,5% de detergente e incube em temperatura ambiente, protegido da luz por 15 min. Centrifugue a placa a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Elimine o sobrenadante conforme descrito anteriormente (passo 2.3) e lave o pellet da célula uma vez com 150 μL de tampão FACS + 0,5 % de detergente. Ressuspenda o pellet celular em 20 μL de tampão FACS + detergente a 0,5% contendo os anticorpos de interesse (CD68-APC, CD206-PE) e incube, protegido da luz, em temperatura ambiente por 30 min.
- Adicione 130 μL de tampão FACS + 0,5% de detergente a cada poço e centrifugue a placa a 400 x g por 5 min a 4 ° C. Descarte o sobrenadante conforme descrito anteriormente (etapa 2.3) e lave os pellets da célula duas vezes com 150 μL de tampão FACS + 0,5% de detergente.
NOTA: Se estiver usando um anticorpo primário não conjugado ou um anticorpo primário conjugado à biotina, um reagente secundário apropriado, conjugado a um fluoróforo, pode ser adicionado neste ponto e as etapas 2.9-2.10 repetidas. - Ressuspenda os grânulos celulares em 150 μL de tampão FACS + 0,5% de detergente e armazene, protegido da luz, a 4 °C por até dois dias.
- Ressuspenda os grânulos celulares com 150 μL de tampão FACS + 0,5% de detergente suplementado com 5 μg/mL4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e incube por 5 min em temperatura ambiente, protegido da luz. Centrifugue a placa a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante conforme descrito anteriormente (passo 2.3).
- Ressuspenda os grânulos celulares em 150 μL de PBS e transfira para um tubo FACs devidamente rotulado. Armazenar em temperatura ambiente, protegido da luz, até que esteja pronto para análise.
NOTE: Após a ressuspensão em PBS, as células devem ser analisadas em poucas horas, pois o DAPI se dissociará lentamente do DNA, levando a uma perda de sinal.
3. Configuração de citometria de fluxo e execução de amostras
- Certifique-se de que o citômetro de fluxo esteja equipado com os lasers e/ou conjuntos de filtros apropriados para medir os fluoróforos usados para corar as células. Isso pode ser determinado na configuração padrão do citômetro no sistema. No caso desse protocolo, as células foram analisadas por meio de um citômetro de fluxo equipado com três lasers (405 nm, 488 nm e 633 nm) permitindo a detecção de ≤ 5 fluoróforos.
- Selecione os canais apropriados para detecção de fluoróforos de interesse. Todos os sinais fluorescentes são melhor detectados com amplificação logarítmica.
- Selecione uma taxa de fluxo apropriada para as amostras. Este parâmetro pode variar dependendo do sistema usado e deve ser determinado empiricamente. No caso deste protocolo, uma taxa de fluxo de MED-to-HI (35-60 μL/min) foi usada para evitar o entupimento da agulha.
- Selecione o número total de eventos/células a serem coletados por amostra. O número mínimo de eventos deve ser 1.000.000.
- Crie gráficos de dispersão em uma planilha global da área de dispersão lateral (SSC-A) versus área de dispersão direta (FSC-A), bem como para cada fluoróforo de interesse versus FCS-A. Crie uma visualização estatística que exibirá o número de eventos e a intensidade fluorescente média (MFI) para os fluoróforos selecionados.
- Defina a tensão dos canais FSC-A e SSC-A, de modo que as células menores caibam nos 10% inferiores esquerdos do gráfico de dispersão. Determine a fluorescência de fundo e a fluorescência mínima da amostra dos controles não corados dos nervos ciáticos ou DRGs. Determine a porta pai (P1) com base no gráfico de dispersão dos controles de coloração somente DAPI.
NOTE: Este não é um portão de coleta, devido em parte à natureza heterogênea da população DAPI+ no sistema nervoso periférico (SNP). - Usando os gráficos de dispersão FSC para cada um dos fluoróforos de interesse, ajuste as tensões para que as células do controle não corado caiam dentro do quarto inferior de seus respectivos gráficos de dispersão. As portas são então criadas acima dessa região para definir as células que são positivas para cada um dos respectivos marcadores/fluoróforos. A colocação de uma porta é confirmada pela execução do controle de coloração simples (etapa 2.1).
NOTA: A compensação de espectros de emissão sobrepostos pode ser realizada neste ponto ou aplicada retrospectivamente com o software de análise apropriado. - Uma vez que o citômetro de fluxo tenha sido configurado, conforme descrito, as amostras podem ser executadas.
- Após a execução, o material de amostra restante pode ser descartado e os arquivos FCS podem ser exportados para análise posterior.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 Mouse | |||
| DMEM (+1g/L de glicose, glutamina, piruvato) | |||
| HEPES | |||
| Albumina de soro bovino (BSA) | |||
| Collagenase Type 4 | |||
| Deoxyribonuclease (DNase) I do pâncreas bovino I | |||
| Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)< | |||
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | |||
| Anticorpo contra CD11b-PerCP/Cy5.5< | |||
| Anticorpo contra MHC classe II, biotinilated | |||
| Anticorpo contra CD45-A647 | |||
| Streptavidin-PE/Cy7 | Usado para detectar MHCII-biotina com CD45-A647 e CDllb-PerCP/Cy5.5< | ||
| Triton-X 100 | |||
| DAPI | |||
| Cell dissociation sieve - tissue grinder kit | |||
| V-Shaped, placas de 96 poços< | |||
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | |||
| 60x15mm petri dish | |||
| BD LSR II Flow Cytometer |
