Imagem in vivo da retina de camundongo usando tomografia de coerência óptica

Resumo

Source: <a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/55865/ coerência-óptica-tomografia-imagem-de-camundongo-células-ganglionares-de-retina-em-vivo'>Jagodzinska, J., et. al., Tomografia de Coerência Óptica: Imagem de células ganglionares da retina de camundongos In Vivo. J. Vis. exp. (2017)

Neste vídeo, demonstramos o uso da tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) para obter imagens das camadas da retina e avaliar as mudanças estruturais em um modelo de camundongo geneticamente modificado com neuropatia óptica.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação do mouse

1. Dilatação e imobilização dos olhos
   1. < span style = 'font-family: Arial, sans-serif; tamanho da fonte: 12pt; estilo da fonte: normal; variante da fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto: nenhum; alinhamento vertical: linha de base; espaço em branco: pré-embrulho; '> Pelo menos 15 minutos antes da aquisição dos dados, instilar colírio de fenilefrina a 10% nos olhos do mouse, remover o excesso e instilar colírio de tropicamida a 0,5%.
      NOTE: A primeira dilatação pode ser feita de uma só vez para todos os camundongos que serão testados na sessão. Certifique-se de que os líquidos estejam em temperatura ambiente.
   2. Imediatamente após a indução da anestesia geral (etapa 1.2), administre colírio de cloridrato de oxibuprocaína a 0,4%, mantendo-o no lugar por 3 s para anestesiar e imobilizar os olhos. Em seguida, limpe as gotas e repita a instilação de fenilefrina a 10% e tropicamida a 0,5% para verificar se os olhos estão bem dilatados.
      NOTE: Certifique-se de que os líquidos estejam em temperatura ambiente e que o camundongo não engula a oxibuprocaína.
2. Anestesia geral
   1. Prepare uma solução anestésica de cetamina (20 mg/mL) e xilazina (1,17 mg/mL) em solução salina. Conservar a 4 °C durante um máximo de 2 semanas.
   2. Aproximadamente 5 min antes do teste, injete intraperitonealmente 5 - 10 μL de solução anestésica por 1 g de massa corporal, dependendo da idade e tamanho do camundongo.
      NOTA: Camundongos jovens e / ou magros precisam de menos anestesia, levam menos tempo para anestesiar, mas também despertam mais rápido. Aqui, 8 μL / g (160 mg / kg de cetamina, 9,33 mg / kg de xilazina).
   3. Opcionalmente, lubrifique os olhos com colírio viscoso ou gel oftálmico para evitar o ressecamento da córnea.

2. Posicionamento do mouse

1. Lubrifique os olhos com colírios viscosos à base de glicol para fornecer hidratação da córnea.
   NOTE: Se os olhos parecerem secos Durante o exame, reaplique o colírio.
2. Enrole o mouse em uma folha de gaze cirúrgica para mantê-lo aquecido.
3. Usando uma esponja ou pavio de algodão, aplique uma fina camada de gel oftálmico com 0,3% de hipromelose em cada olho, para minimizar a refração da luz, evitar opacidades e garantir a hidratação da córnea. Ao fazer isso, afaste os cílios e os bigodes.
4. Posicione o mouse no cassete, com a cabeça reta e apontando para a frente.
5. Abra suavemente a barra de mordida clamp e coloque a barra na boca; Use a faixa do nariz para fixar a posição.
   NOTA: Certifique-se de que A barra de mordida está no meio do cassete.
6. Coloque um rolo de algodão sob o lado direito (esquerdo) se o olho direito (esquerdo) estiver sendo testado.
7. Enquanto mantém a ponta de mira de encaixe na lente específica do mouse, traga-a em direção ao olho girando o parafuso do tradutor Z no sentido anti-horário.
8. Girando e girando o cassete e girando a barra de mordida e os parafusos do tradutor X, pré-defina a posição do mouse; O objetivo é fazer com que o olho direito olhe diretamente para a lente e, assim, alinhar os eixos ópticos dos olhos e da lente.
   NOTE: Se o mouse estiver muito alto ou muito baixo, o parafuso do tradutor Y deve ser usado primeiro.
9. Escolha a primeira varredura no "Exame", clique em "Começar a mirar" e faça outros ajustes manuais para imagens de retina.
   1. Usando o parafuso do tradutor Z, mova a retina verticalmente no painel esquerdo (Figura 1, Horizontal B-scan Alignment) e horizontalmente no painel direito (Figura 1, Vertical B-scan Alignment).
   2. Gire o cassete para colocar o ONH no meio do painel direito, movendo o ONH para cima ou para baixo. Use o parafuso da barra de mordida para endireitar a retina no painel direito. Gire o cassete para posicionar o ONH no meio do painel esquerdo.
   3. Use o parafuso do tradutor X para nivelar a retina no painel esquerdo. Tendo em mente a função principal de cada modulador, ajuste ainda mais a posição da retina para centralizar o ONH.
      NOTA: Use o parafuso do tradutor em Y para mover o ONH para cima e para baixo no painel direito, se necessário. A posição pode ser refinada a qualquer momento entre as varreduras.

3. Imagem SD-OCT do ONH e Retina

1. Depois de concluir os ajustes, clique em "Iniciar instantâneo" para iniciar a digitalização do SD-OCT.
   1. Se uma imagem 3D não for necessária, desmarque a opção OCU.
2. Salve a verificação e o relatório.
3. Prossiga com as próximas verificações.
4. Para obter a imagem do segundo olho, depois de retrair a lente, gire o cassete de acordo e repita as etapas 2.6 - 3.3.

4. Conclusão da aquisição

1. Quando a aquisição estiver concluída, remova o mouse do cassete, aplique gel oftálmico com hipromelose a 0,3% em cada olho e coloque o mouse em uma placa de aquecimento para acordar.
2. Após a última aquisição, feche o software e desligue o computador e a máquina OCT (botão da fonte de alimentação).
3. Limpe o cassete com desinfetante.

5. Análise

1. Para a medição da espessura da camada retiniana, use o software de segmentação automatizada fornecido pelo fabricante.
   1. Clique em "Paciente", escolha o "Exame" desejado na lista e clique na opção "Revisar exame".
   2. Carregue os dados da OCT desejados no software da OCT clicando com o botão direito do mouse no ícone da pasta na verificação desejada.
   3. Clique com o botão direito do mouse no B-scan; configurar as pinças habilitando até 10 pinças de medição; e digite seus nomes, ângulos e cores.
   4. Escolhendo o paquímetro desejado clicando com o botão direito do mouse no B-scan; Coloque-o de acordo com a retina para medição.
      NOTE: Para as varreduras centralizadas no ONH, coloque 5 paquímetros de cada lado, equidistantes um do outro. Para a análise peripapilar, certifique-se de que a pinça não esteja muito longe da ONH. Para varredura radial, analise 10 imagens por varredura que foram escolhidas pelo software OCT. Seus números podem ser encontrados na pasta "Relatórios".
   5. Salve os resultados para análise em um programa de software de planilha clicando com o botão direito do mouse no B-scan e clicando em "Salvar resultados".
      NOTE: Os resultados podem ser encontrados na mesma pasta que os dados de digitalização.
2. Como alternativa, use a macro de paquímetro caseiro, "MRI Retina Tool", desenvolvida para um programa de processamento de imagem de código aberto (consulte a Tabela de Materiais).
   1. Certifique-se de que as macros "MRI Retina Tool" e "Modify Polygon Section Tool" estejam ativas. Carregue a imagem. Clique no botão m para iniciar a medição.
      NOTA: A macro cria automaticamente um cassete de medição de 0,2 mm de comprimento em ambos os lados do ONH. Cada cassete contém 5 pontos de medição que funcionam como paquímetros. Sua posição lateral é imutável e é personalizada para a peripapila nas varreduras radiais. A posição horizontal dos cassetes é predefinida para medir a espessura RNFL / GCL, mas é facilmente modificável para medir a camada complexa de GC. Se a qualidade da digitalização for ruim, a posição horizontal precisará ser ajustada ou a imagem precisará ser excluída da análise.
   2. Para ajuste horizontal, clique no botão e. Na janela "ROI Manager" recém-aberta, escolha o primeiro cassete.
   3. Clique no botão azul do polígono e ajuste a posição do primeiro cassete clicando nas bordas da camada medida na imagem.
   4. Repita para o segundo cassete escolhendo-o primeiro na janela "ROI Manager" e clicando na imagem apropriada. Clique no botão r para medir novamente. Veja os resultados na janela "Medições".
      NOTE: Os resultados podem ser copiados para um programa de software de planilha a qualquer momento. Eles contêm os seguintes valores para o cassete direito (r), o cassete esquerdo (l) e o total: Intden - densidade integrada dentro do cassete; Área: área de medida, em mm2; Len: comprimento do paquímetro dentro do cassete, em mm; Média: intensidade média do sinal dentro do cassete; e Std: erro padrão da intensidade média do sinal.
   5. Prossiga com a próxima imagem.
   6. Analise ainda mais os dados em um programa de software de planilha.
      NOTA: Para encontrar a espessura média da camada, pegue os dez valores de Len.

Resultados

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Mice
Opa1delTTAG mouse	Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, França	-	Opa1 knock-in camundongos portadores de mutação OPA1 c.2708_2711delTTAG no fundo C57Bl6/J
Equipment
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System	Bioptigen, Leica Microsystems, Alemanha	-	Sistema de tomografia de coerência óptica de domínio espectral
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software	Bioptigen, Leica Microsystems, Alemanha	-	Software para aquisição e análise de OCT
ImageJ 1.48v	Wayne Rasband, National Institutes of Health, EUA	-	Software para análise, requer o download e a instalação de duas macros hommade: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool
Placa de aquecimento autorregulável	Bioseb, France	BIO-062	Proteção contra hipotermia
Supplies
Gauze pads 3"x3"	Curad, EUA	CUR20434ERB	Proteção contra hipotermia
Aplicador de ponta de algodão de ponta	Essence of Beauty, CVS Health Corporation, EUA	-	Gel application
Cotton Twists	CentraVet, França	T.7979C.CS	Posicionamento do mouse
Reagents and Drugs
Néosynéphrine Faure 10%	Laboratoires Europhtha, Mónaco	-	Dilatação dos olhos
Mydriaticum 0.5%	Laboratoires Théa, França	3397908	Dilatação dos olhos
Cebesine 0.4%	Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, França	3192342	Local anesthesia
Imalgene 1000	Merial, França/CentraVet, França	IMA004	General anesthesia
Rompun	Bayer Healthcare, Alemanha/CentraVet, França	ROM001	Anestesia geral, analgesia, relaxamento muscular<
NaCl 0,9%	Laboratoire Osalia, França	103697114	Physiological serum
Systene Ultra	Alcon, Novartis, USA	-	Hidratação dos olhos
GenTeal'	Alcon, Novartis, USA	-	Gel oftálmico para minimizar a refração da luz e opacidades
Aniospray Surf 29	Laboratoires Anios, França	59844	Disinfectant

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