Imagem de lapso de tempo da migração radial de neurônios corticais em fatias de cérebro embrionário de camundongo transduzidas

Resumo

Source:<a style='text-decoration:none;' href='https://dx.doi.org/10.3791/55886-v'> Wiegreffe, C., et. al., Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra a microscopia confocal de lapso de tempo para observar a migração radial do neurônio cortical da zona subventricular para a placa cortical por meio de andaimes gliais radiais em fatias de cérebro embrionário de camundongo transduzidas.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pela revisão ética animal apropriada comitê.

1. Imagem de lapso de tempo

1. Microscope Setup
   1. < span style = 'família de fontes: Arial, sans-serif; tamanho da fonte: 12pt; estilo da fonte: normal; variante da fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto: nenhum; alinhamento vertical: linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento; '> Defina uma câmara climática colocada no palco de um microscópio confocal invertido para 37 ° C e 5% de atmosfera de dióxido de carbono. Use um detector híbrido para reduzir a intensidade do laser e melhorar a viabilidade celular. Para uma análise detalhada, use uma objetiva seca de 40X com uma abertura numérica de 0,6 ou superior.
      Nota:<span style='font-family:Arial,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > Todos os componentes do microscópio precisam ser pré-aquecidos a 37 °C por 2 a 3 h antes da imagem para fornecer um foco estável durante o processo de imagem.
2. Slice Imaging
   1. Selecione uma fatia de cérebro para imagem da placa de 6 poços contendo as inserções de membrana usando um microscópio de fluorescência invertida.
      Caution: Evite o tempo de exposição prolongado à luz ultravioleta, pois isso pode causar fotodanos celulares.
      NOTE:<span style='font-family:Arial,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > Selecione uma fatia com neurônios únicos brilhantes na ZVS superior (zona subventricular) migrando radialmente em direção à superfície pial da fatia. Processos fluorescentes finos de células gliais radiais que abrangem todo o CP (placa cortical) indicam um andaime glial radial intacto, que é usado por neurônios corticais que migram radialmente.
   2. Transfira a inserção da membrana com a fatia, que foi selecionada para a imagem de lapso de tempo, para uma placa de fundo de vidro de 50 mm de diâmetro contendo 2 ml de meio de cultura de fatias com a ajuda de uma pinça. Coloque o prato na câmara climática do microscópio confocal.
   3. Defina a resolução para 512 por 512 pixels e aumente a velocidade de varredura de 400 Hz para 700 Hz para aumentar a taxa de quadros de cerca de 1,4 para cerca de 2,5 quadros por segundo, respectivamente. Use no máximo duas vezes a média. Defina uma pilha z através da região eletroporada (geralmente 400-100 μm) com um tamanho de passo de 1,5 μm. Coletivamente, essas configurações permitem uma resolução e brilho suficientes da imagem, mantendo o fotodano baixo durante a aquisição. Comece a série de lapso de tempo tomando uma pilha z a cada 30 minutos.
      NOTE:<span style='font-family:Arial,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > A exposição prolongada da fatia à luz do laser induzirá fotodanos, reduzindo a viabilidade das células. Ajuste o tempo de exposição à luz laser de acordo.
   4. Analise séries de lapso de tempo usando o software ImageJ (https://imagej.nih.gov/iij/) ou equivalente.

Materiais