Ablação seletiva a laser de neurônio único em uma larva de peixe-zebra usando um microscópio confocal

Resumo

Source: Morsch, M., et. al., Triggering Cell Stress and Death Using UV Laser Confocal Microscopia Convencional. J. Vis. Exp. (2017)

Neste vídeo, exploramos a técnica de ablação a laser UV de alta intensidade para direcionar e estudar com precisão neurônios individuais em peixes-zebra transgênicos. Demonstramos como preparar, imobilizar e visualizar respostas neuronais, destacando a dinâmica celular da lesão e recuperação.

Protocolo

1. Prepare soluções para incorporação de peixe-zebra em agarose.
   1. Prepare uma solução anestésica adicionando 4 g/L MS222 (solução estoque de tricaína, pH 7,0) gota a gota a uma placa de Petri contendo água de ovo. Uma dose de 50 mg/L é um ponto de partida recomendado (Figura 1A).
   2. Prepare um estoque de agarose de baixo ponto de fusão (0,8 - 1,5%) em água de ovo e alíquota em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Coloque uma alíquota em um bloco de calor pré-aquecido (38 - 40 °C) e deixe-a equilibrar até a temperatura definida (~ 30 min; Figura 1B).
   3. Opcional: Para imagens de longo prazo (> 4 h), prepare um pequeno círculo de agarose dentro da placa de Petri com fundo de vidro de 35 mm e deixe-o endurecer.
      NOTA: Este passo extra foi eficaz para evitar qualquer movimento de toda a gota de agarose com o peixe-zebra em períodos de tempo mais longos.
      1. Para fazer isso, coloque ~ 300 μL de agarose ao longo do círculo interno do prato com fundo de vidro para preparar um círculo em forma de rosquinha com uma pequena abertura no meio para colocar o peixe (etapa 1.5.3).
2. Monte o peixe-zebra em agarose para microscopia.
   1. Selecione 1 - 3 dos peixes pré-selecionados para ablação e anestesie as larvas transferindo-as (usando uma pipeta de transferência) para um prato com a solução anestésica (etapa 1.4.1; Figura 1C; aproximadamente 5 min).
      NOTA: Os peixes são anestesiados quando mostram um movimento opercular raso e uma frequência cardíaca diminuída e não exibem mais uma resposta de fuga evocada pelo toque (TEER; falha em nadar para longe depois de tocar suavemente a cauda com uma escova). Garantir anestesia adequada para o tratamento ético dos peixes e evitar espasmos após a transferência para agarose ou exposição à luz fluorescente.
   2. Após a confirmação da anestesia, aspire uma larva usando uma pipeta ajustável (com uma ponta de corte de 200 μL ajustada para ~ 30 μL) e deixe-a afundar até o fundo da ponta. Transfira a larva para a agarose pré-aquecida (etapa 1.4.2) liberando uma gota do líquido com a larva na agarose (tente minimizar a quantidade de água do ovo que entra na agarose; Figura 1D).
   3. Chupe o peixe cercado por agarose. Distribua-o rapidamente no prato de 35 mm com fundo de vidro previamente preparado.
   4. Use um microscópio de dissecção e um pincel padrão (forro longo, tamanho 1) para posicionar o animal dentro da agarose na lateral (cabeça para a esquerda) de modo que o corpo e a cauda fiquem planos (Figura 1E). Se estiver trabalhando com vários peixes, alinhe todos os peixes no prato para que sejam facilmente localizados usando o microscópio confocal posteriormente.
      NOTE: Execute rapidamente este procedimento de posicionamento e alinhamento (pode exigir alguma prática, pois a agarose começa a endurecer imediatamente após a exposição a temperaturas mais frias).
   5. Deixe o peixe embebido em agarose por 10 a 15 minutos até que a agarose esteja firme. Encha cuidadosamente a placa de Petri de 35 mm com ~ 2 mL de água de ovo contendo tricaína (Figura 1F).

2. Configurar o microscópio confocal e os parâmetros de imagem

1. Coloque a placa de Petri com a larva embutida no estágio do microscópio confocal e concentre-se no lado dorsal da medula espinhal do animal (usando campo claro). Examine o animal sob a ampliação apropriada (40X) e configuração fluorescente e visualize a estrutura de interesse (e.g., intensidade de fluorescência dos neurônios marcados ou movimento microglial) para confirmar que todos os parâmetros de imagem são necessários para a ablação subsequente (Figura 2). Usamos rotineiramente o objetivo 40X para realizar nossos estudos de lapso de tempo.
2. Opcional: Para realizar um estudo de lapso de tempo por várias horas, é aconselhável registrar um ou alguns pontos de tempo antes da ablação para estabelecer a resposta fisiológica imperturbável da célula e seu ambiente (ex., movimento microglial para estabelecer a velocidade e a motilidade da linha de base).
3. Determine a espessura da estrutura de interesse para a ablação a laser UV.
   1. Usando o z-drive, verifique a parte superior e inferior da estrutura de interesse (ex., cell soma) focando manualmente para cima e para baixo. Anote o plano z que será ablacionado (e.g., centro da célula).
      NOTE: Por experiência, esse método foi mais eficaz ao direcionar os neurônios da medula espinhal que foram brilhantemente marcados (uma alta relação sinal-ruído que permite fácil visualização de lapso de tempo após a ablação; e.g., Figura 4) e pela ablação do meio do soma celular. A fluorescência do núcleo celular pode ser vantajosa para garantir o direcionamento correto e alta eficiência de ablação.

3. Execute a ablação a laser direcionada de células individuais no peixe-zebra Medula espinhal

NOTA: Para esta abordagem de ablação e visualização, foi utilizado um microscópio confocal (Leica SP5). O procedimento de ablação usando um diodo de 405 nm para destruição específica da célula é detalhado de acordo com o software (Leica Application Suite, v2.7.3.9723). No entanto, qualquer microscópio confocal convencional equipado com um laser de 405 nm e um FRAP (recuperação de fluorescência após fotobranqueamento) ou módulo de branqueamento permitirá a realização das mesmas manipulações celulares, mas potencialmente com configurações, parâmetros e nomes ligeiramente diferentes.

1. Inicie o assistente FRAP clicando no menu suspenso na parte superior do menu do software (Figura 3A, 1 and 2). Observe uma nova janela com diferentes etapas que permite a configuração dos parâmetros específicos para a ablação a laser (Figura 3B, 3).
2. Determine os parâmetros de imagem para a abordagem de ablação selecionando o formato, a velocidade de varredura (Figura 3B, 4) e média (Figura 3B, 5). Um formato de imagem de 1.024 x 1.024 a uma velocidade de varredura de 400 Hz e uma média de linha de 4 foi o mais aplicável.
   NOTA: Geralmente não há necessidade de alterar a detecção espectral (como os parâmetros de excitação ou emissão), pois eles foram determinados na aquisição anterior.
   1. Se o plano z para ablação ainda não tiver sido selecionado (conforme descrito na etapa 2.4.), pressione o botão "Live" e foque através da amostra até que a estrutura fluorescente ou o plano z desejado que será ablacionado esteja em foco.
3. Depois que os parâmetros gerais da imagem forem definidos, acesse a etapa "Bleach" (Figura 3C, 6) para controlar os componentes de ablação específicos.
   NOTA: A combinação da intensidade do laser (Figura 3C, 8), a velocidade de varredura e a média que foi definida na etapa 3.2 (Figura 3B, 4 e 5), bem como o número de repetições que serão definidas na etapa 3.5 (Figura 3E, 12), determinará o tempo total de permanência do laser UV no ROI e, portanto, a eficiência do branqueamento.
   1. Ative o laser de 405 nm ativando-o para o procedimento de branqueamento (Figura 3C, 8).
      NOTA: O maior sucesso com as configurações mencionadas acima foi alcançado com intensidades de laser de 405 nm entre 60 e 80% em nossa configuração experimental. Esteja ciente de que essa saída de potência do laser é específica do instrumento e será diferente para cada configuração confocal.
   2. Use a opção "ampliar" (Figura 3C, 7) maximizar a intensidade do branqueamento no ROI selecionado, reduzindo o campo de varredura, maximizando assim o tempo de permanência. Como alternativa, use a opção "Bleach point" do software de sua escolha para este processo.
4. Selecione um ou vários ROIs (Figure 3D, 10) para a ablação usando qualquer uma das ferramentas de desenho na janela de aquisição de imagem (Figura 3D, 9). Mire no outeiro do axônio, por exemplo, com a ferramenta de desenho circular de aproximadamente 4 a 8 μm.
   NOTE: A área de ablação é ajustável de um único pixel para uma área maior, dependendo da aplicação.
5. Depois de estabelecer o ROI, selecione o botão "Time Course" (Figura 3E, 11) e confirme o número de ciclos em que as ROIs serão verificadas/abladas (Figura 3E, 12). Escolha as molduras "Pré-branqueamento" e "Pós-branqueamento" conforme desejado para permitir uma visão geral de toda a imagem imediatamente antes e imediatamente após o processo de branqueamento.
6. Depois de estabelecer todos os parâmetros de ablação necessários, pressione "Executar experimento" (Figura 3E, 13) e monitore a eficiência da ablação.
   NOTE: Em nossa configuração FRAP, uma única imagem será tirada antes e depois do ciclo FRAP com a excitação de laser apropriada (ex., excitação de 488 nm para células que expressam EGFP). Essas imagens pré e pós-ablação permitem um julgamento rápido de quão satisfatoriamente o ROI foi branqueado e quão eficazes foram os parâmetros de ablação escolhidos.
7. Repita o processo ajustando a intensidade do laser (Figura 3C, 8), velocidade de varredura e média (Figura 3B, 4 e 5) e repetições (Figura 3E, 12) caso o ROI selecionado ainda mostre alta intensidade de fluorescência após a conclusão do FRAP ciclo.

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