Imagens TSPO-PET/CT para detectar a formação de infarto em um modelo de camundongo com AVC isquêmico

Resumo

Source: Chaney, A. M., et.al. Imagem PET de neuroinflamação usando [¹¹C]DPA-713 em um modelo de mouse de traço isquêmico. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra uma técnica para imagens in vivo de neuroinflamação em um modelo de camundongo de AVC isquêmico usando um Radiotraçador específico para TSPO. Após a injeção, o radiotraçador se liga ao TSPO, uma proteína localizada na membrana mitocondrial externa e superexpressa em células imunes ativadas. Um scanner PET/CT detecta a distribuição do radiotraçador e gera uma imagem co-registrada com dados de TC, permitindo a localização precisa de regiões neuroinflamatórias no cérebro.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Calibrações de PET/CT e configuração do fluxo de trabalho (6 dias após a cirurgia dMCAO)

1. Crie um fluxo de trabalho de imagem no software operacional do scanner para incluir uma aquisição de atenuação de TC, aquisição dinâmica de PET C-11 de 60 minutos (discriminação de nível de 350 - 650 keV, janela de coincidência de 3,438 ns), histograma (20 quadros: 5 x 15 seg, 4 x 1 min, 11 x 5 min; com correção de tempo morto) e uma reconstrução 3DOSEM-OP (2 iterações, 18 subconjuntos) para criar imagens de 128 x 128 x 159 com tamanho de voxel de 0,776 x 0,776 x 0,96 mm.
2. Execute o condicionamento da fonte de raios X por meio do painel de calibração de TC localizado no canto superior esquerdo da interface. Esta calibração deve ser realizada semanalmente ou antes da varredura se o sistema não tiver sido usado nas últimas 48 h.
{TAG_27}}Execute calibrações de escuro/claro (D/L) e deslocamento central (C/O).
1. Pressione o botão de calibração do TC (X) no canto superior esquerdo da interface.
2. Selecione D/L e C/O para o arquivo CT que você executará, remova o leito do pórtico e execute a calibração D/L.
3. Insira a base da ferramenta de calibração no scanner e execute a calibração C/O, certificando-se de alternar a seleção na interface para "ferramenta de calibração" em vez de "paleta de 70 mm".
3. Remova a ferramenta de calibração e retorne o leito PET padrão, certificando-se de alterar a seleção na interface de volta para "paleta de 70 mm".
4. Prenda uma cama de imagem de 4 mouses na plataforma do scanner usando fita adesiva e prenda o tubo de anestesia (Figura 1A). Certifique-se de que o isoflurano esteja fluindo através dos tubos e que não haja dobras.
5. Empurre a cama para frente para que fique no centro do campo de visão (FOV), feche a porta do CT e obtenha uma visão de reconhecimento do CT para garantir que a cama esteja na posição correta.
6. Realize uma calibração "padrão" do scanner PET/CT usando um simulador fabricado internamente contendo uma dose conhecida de solução C-11 como fonte de radiação.
   1. Prepare uma seringa de 20 mL cheia com a dose de marcador equivalente à administrada a um camundongo (~ 250 - 350 μCi / 9 - 13 MBq de C-11
   2. Registre a atividade no padrão usando um calibrador de dose e anote o tempo de medição.
   3. Realize uma varredura PET/CT do padrão usando exatamente os mesmos parâmetros que serão usados para obter imagens de camundongos (conforme descrito acima). Faça isso semanalmente para criar um fator de correção para o scanner PET aplicar aos dados de imagem.

2. Configuração do espaço de trabalho para imagens PET/CT

1. Crie um ambiente estéril usando um desinfetante com virucida (consulte Tabela de Materiais) e colocando acolchoamento absorvente protetor em todas as superfícies.
2. Certifique-se de que os tanques de isoflurano e oxigênio estejam adequadamente cheios.
3. Prepare os cateteres da veia caudal enchendo uma seringa de 1 mL (equipada com uma ponta de agulha de 27,5 G) com cloreto de sódio a 0,9% (solução salina estéril) e lavando através de um cateter borboleta de 27,5 G, 24 cm. Corte as asas do cateter antes de canular, para garantir que não bloqueiem a visão da veia da cauda e para ajudar a mover os ratos para o scanner sem deslocar o cateter.
4. Certifique-se de que todos os equipamentos essenciais estejam dispostos na estação de trabalho, incluindo seringas sobressalentes de "descarga" (cheias de solução salina estéril), lubrificante ocular, cotonetes de etanol, lâmpadas de calor, cateteres preparados (pré-preenchidos com solução salina), fita cirúrgica, cola de tecido, seringas de dose de 0,5 mL, tesoura e um isqueiro para selar o cateter após a colocação bem-sucedida na veia da cauda (Figura 1B).

3. Preparação e canulação de animais

{TAG_158}}

}Pesar os camundongos para determinar o volume máximo que pode ser injetado em cada camundongo (, ou seja, volume do marcador e qualquer solução salina administrada não deve exceder 10% do peso corporal).

Anestesiar camundongos em uma câmara de indução usando isoflurano a 3% e manter a 1-2% (2 L / min 100% O₂).

Aplique lubrificante ocular em cada mouse e confirme a anestesia por meio de reflexo pedal (pinça do dedo do pé). Ajuste os níveis de anestesia, se necessário.

Coloque o mouse em uma cama aquecida equipada com um cone nasal para fornecer isoflurano a 1-2% (2 L / min 100% O₂{TAG_197}}).

Enquanto o mouse está anestesiado, execute a canulação da veia da cauda usando o seguinte protocolo:

1. Coloque o mouse de lado para expor uma das veias laterais, enquanto a cabeça permanece no cone do nariz.
2. Aqueça a cauda usando uma lâmpada de calor, tomando cuidado para não superaquecer ou queimar a cauda, e esfregue com um pano embebido em álcool para dilatar a veia e esterilizar o local da injeção.
3. Segure a agulha com o chanfro para cima e alinhe-a com a veia em um ângulo agudo.
4. Aplique levemente pressão para perfurar a pele e nivele a agulha para que fique alinhada com a veia.
5. Empurre suavemente alguns milímetros além do chanfro para que a agulha entre na veia.
6. Confirme se o cateter está inserido administrando uma pequena descarga (10-20 μL) de solução salina. A solução salina deve deixar a seringa suavemente e a veia deve desobstruir. Se for observada alguma resistência ou contrapressão, é provável que o cateter não esteja na veia e é aconselhável tentar novamente a canulação. Se a coagulação for observada, use heparina (1.000 unidades de heparina por mL de solução salina) para configuração da canulação e lavagem.
   NOTA: Avaliamos a canulação com e sem heparina na cepa de camundongo de interesse e, como não foi observada coagulação, apenas solução salina foi usada para canulações.
7. Prenda o cateter à cauda usando uma pequena gota de cola de tecido, seguida de fita cirúrgica, para garantir que o cateter permaneça imóvel ao transferir os mouses para o scanner.
8. Remova a seringa de descarga da extremidade do cateter e sele a extremidade com um isqueiro, garantindo que o pesquisador não esteja perto de isoflurano ou etanol.
9. Repita para 3 camundongos adicionais para que todos os 4 camundongos a serem escaneados sejam canulados e preparados.

Ligue o fluxo de anestesia (2,5% de isoflurano, 2 L/minuto 100% O₂{TAG_280}}) conectado ao PET/CT e posicione cuidadosamente os camundongos de bruços na cama do scanner, garantindo que os cateteres permaneçam no lugar e que a cabeça de cada camundongo esteja reta e segura dentro do cone do nariz. Prenda a cabeça e o corpo de cada camundongo na cama com fita cirúrgica macia, garantindo que a respiração não seja restringida pela colocação da fita. Registre a posição de cada mouse para permitir a localização correta e a alocação de grupos para análise de imagens.

Mantenha os ratos aquecidos durante todo o procedimento (, por exemplo, usando uma lâmpada de calor ou sistema de bomba de ar quente para garantir que os ratos sejam mantidos aquecidos sem superaquecimento). Monitore a frequência respiratória de todos os camundongos, visualmente se estiver usando um pórtico aberto ou por meio de um sistema de monitoramento remoto usando almofadas respiratórias, e altere os níveis de anestesia conforme necessário.

4. Aquisição de TC

1. Assim que os animais estiverem seguros na cama e a respiração estiver estável, ligue a mira do laser e mova a plataforma de varredura para que eles se alinhem com o cérebro de todos os quatro camundongos. Mova a base do scanner para a posição de aquisição (posição 3) com os cérebros dos camundongos o mais próximo possível do centro do FOV.
2. Adquira uma imagem de visualização de reconhecimento dos mouses para verificar sua posição (use um FOV de 200 mm) e ajuste a posição arrastando a caixa de FOV na interface, se necessário. Clique em "Iniciar fluxo de trabalho" no software do scanner para iniciar a tomografia computadorizada, certificando-se de selecionar "exibir prompts interativos do usuário" para que a varredura PET possa ser iniciada manualmente antes da injeção do traçador.

5. [¹¹C]DPA-713 Preparação da dose

1. Sintetizar [¹¹C]DPA-713, garantir que você esteja usando EPI (equipamento de proteção individual) apropriado para lidar com radioatividade, incluindo jaleco, luvas e dosímetros pessoais de dedos e corpo. Certifique-se de trocar as luvas regularmente para evitar contaminação radioativa e aumente a distância da fonte radioativa quando possível.
2. Use uma pinça para transferir cuidadosamente o frasco do radiotraçador para trás de uma blindagem de chumbo.
3. Preparar seringas de dose de 0,5 ml para cada ratinho contendo aproximadamente 250-350 μCi/9-13 MBq em volume de 100-200 μL para garantir uma dose adequada para uma tomografia por emissão de pósitrons dinâmica de 60 minutos (a dose administrada deve ser determinada tendo em conta a meia-vida do isótopo e a linha temporal da conceção do estudo, com o volume a depender do peso do ratinho).
4. Meça a atividade usando um calibrador de dose ajustado para C-11, localizado próximo ao local da canulação, e registre os tempos de medição e injeção para permitir a correção do decaimento. Elabore as doses imediatamente antes do término da TC para limitar o decaimento e garantir que o nível desejado de radioatividade seja injetado em cada camundongo.
5. Verifique se não há bolhas de ar na seringa doseadora antes de medir a atividade e injetar em cada camundongo.

6. Aquisição de PET

1. Uma vez que os camundongos avançam automaticamente de CT para PET, configure a parte traseira do scanner para [¹¹C]Injeção de DPA-713 (Figura 1C). Coloque o acolchoamento absorvente protetor em uma borda e certifique-se de que a tesoura e o isqueiro estejam à mão.
2. Corte o tubo selado do cateter com uma tesoura, verifique se as linhas do cateter estão livres de bolhas e confirme se a cânula ainda está dentro da veia realizando uma lavagem de solução salina de 10-20 μL. Carregue as seringas de dose medida da etapa 5.4 em cada um dos 4 cateteres, acompanhando qual dose foi administrada a cada camundongo.
3. Clique em "OK" quando o PET scan estiver pronto para iniciar e, ao mesmo tempo, iniciar um cronômetro de 10 segundos. Tenha dois pesquisadores na parte de trás do scanner com as seringas de dose na mão, para injetar todos os 4 camundongos simultaneamente quando o cronômetro chegar a zero. Lave cada cateter com 50-100 μL de solução salina (dependendo do comprimento do tubo do cateter - , ou seja, o volume morto) para garantir que a dose completa entre na veia da cauda e feche novamente o tubo usando um isqueiro.
4. Meça as seringas de dose usando um calibrador de dose para obter um valor de radioatividade residual (qualquer marcador deixado na seringa). Anote os valores e a hora em que são registrados.
5. Quando a varredura estiver concluída, coloque a cama PET na posição original usando o botão horizontal "home" no painel de controle de movimento. Remova os mouses do scanner e remova cuidadosamente o cateter. Aplique pressão suavemente no local da canulação para evitar sangramento excessivo.
6. Meça a atividade residual no cateter usando um calibrador de dose.
7. Se os ratos forem recuperados, certifique-se de que isso seja feito em um ambiente quente (, por exemplo, em uma caixa com uma almofada aquecida embaixo ou contendo uma luva cheia de água morna) para facilitar a recuperação. Se estiver planejando sacrificar os camundongos, coloque-os em uma câmara de indução contendo isoflurano para que permaneçam anestesiados antes da eutanásia por perfusão.
8. Para reconstruir os dados, abra o software de gerenciamento de pós-processamento (consulte Tabela de Materiais), que reconstruirá automaticamente cada varredura usando os dados do histograma que foram gerados a partir do arquivo lst.

7. Análise dinâmica de imagens PET

{TAG_471}}1. Abra o software de análise de imagem (consulte Tabela de Materiais) e clique no ícone "dados abertos" para carregar a imagem CT (como fonte) e no ícone "anexar dados" para carregar o PET dinâmico (como referência).

2. Execute um controle de qualidade visual dos dados por meio do operador de série temporal no menu suspenso: Selecione referência ("ref") e "global" e aplique um mínimo e máximo apropriados para a escala de cores. Visualize os dados dinâmicos do PET quadro a quadro, verificando a captação de radioatividade e verificando se há confusão de movimento na varredura.

3. Crie uma imagem PET média usando o "operador aritmético".

1. Escolha "média selecionada", desmarque "ref" e certifique-se de que a entrada 1 ("Inp1"), a entrada 2 ("Inp2") e a estrela de entrada ("Inp*" - inclui o restante dos quadros PET na varredura) sejam selecionadas para criar uma média de todos os quadros PET.

2. Vá para a guia "gerenciador de dados" (DM) e arraste a imagem média até a posição "input1" para fins de visualização. Redistribua a escala de cores clicando no cálculo automático na ferramenta "min-max".

4. Registre o TC no arquivo PET médio usando a função "3D automático" no menu suspenso "reorientação/registro".

1. Selecione "ref" e "Inp1" e escolha o registro "rígido", "rápido", "Inp1 para Ref". Verifique visualmente o registro em todas as 3 dimensões e ajuste manualmente, se necessário, na guia "3D manual" usando as funções "translação" e "rotação".

2. Quando estiver satisfeito com o registro, selecione "Inp2" e "Inp*" e aplique a todos os quadros PET clicando na marca de seleção. Clique com o botão direito do mouse nos arquivos CT e PET no DM e salve como raw.

5. Corte o cérebro de um camundongo de cada vez para análise cerebral usando o CT como guia: Selecione "cortar" no menu suspenso e arraste os limites da imagem para cortar a cabeça do mouse abaixo do tronco cerebral. Reoriente as imagens PET e CT usando a função "reorientação 3D manual" conforme descrito acima para que o crânio fique reto em todas as dimensões.

6. Carregue a imagem MR para esse mouse (no formato DICOM) usando o botão "anexar dados" no canto superior esquerdo da interface. Mova o MR usando a "reorientação 3D manual" e ajuste ao crânio dentro da imagem da TC (certifique-se de que todas as modalidades estejam na mesma orientação).

7. Desenhe o ROI do traço na imagem MR usando a "ferramenta ROI 3D".

1. Desative a visualização PET desmarcando-a na guia do controlador visual (VC) e use apenas o MR e o CT para desenhar o ROI.

2. Clique no botão "adicionar ROI" para criar um novo ROI e nomeá-lo como "infarto". Selecione a "ferramenta spline", clique com o botão esquerdo para desenhar a borda do ROI e clique com o botão direito para fechá-la.

3. Repita todas as fatias que abrangem o traço, certificando-se de não capturar nenhum crânio na ROI, com a melhor prática sendo deixar um espaço de voxel entre a borda do crânio e a ROI do traço.

8. Gere uma ROI contralateral usando o volume do infarto.

1. Crie um novo ROI e rotule-o como "contralateral". Clique com o botão direito do mouse no ROI do infarto e selecione "exportar". Arraste o ROI para a posição 2 ("Inp1").

2. Com apenas "Inp1" selecionado, aplique um flip esquerdo para a direita usando a função "operador" no menu "reorientação/registro". Marque a caixa "ROI", escolha "somente visualização" e mova manualmente o novo ROI para a mesma região no lado contralateral. Selecione o operador "aritmético" e aplique uma multiplicação escalar de 2 ao novo ROI, permitindo a quantificação independente dos ROIs.

3. Retorne à ferramenta ROI 3D. Vá para a guia "especialista e experimental" e clique no botão "importar ROI". Selecione Inp1 na caixa de diálogo para carregar o novo volume como o ROI contralateral.

9. Clique com o botão direito do mouse na imagem PET média, descarregue-a e ligue o PET novamente. Gere os resultados de absorção quantitativa usando o ícone "exportar resultados" na ferramenta ROI 3D.

10. Realize análises cerebrais divididas adicionais, se desejar (ou seja, geração automatizada de ROI das regiões do hemisfério cerebral direito versus esquerdo usando um módulo de plug-in de atlas cerebral de mouse 3D para o software Vivoquant).

1. Recarregue as imagens PET/CT registradas.

2. Importe o atlas do cérebro do mouse clicando no menu "módulos avançados" e selecionando a ferramenta 3D do atlas cerebral. Selecione "todas as regiões esquerda/direita" nas "configurações avançadas" e clique em "executar" para importar o atlas 3D.

3. Ajuste manualmente o atlas dentro do cérebro usando o crânio como borda.

4. Execute novamente o atlas, certificando-se de que "importar ROI 3D" esteja marcado para gerar uma planilha de resultados para todas as 14 ROIs dos hemisférios esquerdo e direito (medula, cerebelo, mesencéfalo, ponte, córtex, hipocampo, tálamo, estriado, pálido, bulbos olfativos, corpo caloso e substância branca).

11. Quantifique a captação do traçador no baço usando o software operacional do scanner (consulte Tabela de Materiais).

1. Carregue os arquivos de imagem PET e CT destacando-os no banco de dados e clicando em "análise geral".

2. Clique na aba de cadastro e faça o co-registro de imagens PET e CT clicando no ícone "cadastro rígido".

3. Clique na guia de quantificação de ROI, clique no ícone "criar ROI" e nomeie-o como baço.

4. Escolha a ferramenta "esfera" para desenhar ROIs do baço usando o arquivo CT para referência, garantindo que não haja sobreposição com a captação renal (usando a imagem e o sinal PET para evitar transbordamento dos rins).

5. Edite os ROIs para manter volumes de ROI consistentes entre os animais.

12. Calcule um valor de correção padrão para normalização de captação.

1. Carregue os dados de PET/CT da varredura padrão e crie uma ROI do cilindro abrangendo a seringa de 20 mL usando a ferramenta "ROI 3D manual".

2. Obtenha o nível de radioatividade contido no padrão usando o ícone da planilha.

3. Use este resultado nCi/cc e a radioatividade original registrada para o padrão (ou seja, a medição do calibrador de dose do padrão em nCi/cc) para criar um fator de correção para os valores de captação de PET. Ou seja, divida a radioatividade do padrão registrada pelo calibrador de dose pela radioatividade calculada a partir da imagem PET do padrão.

13. Use as atividades de dose e o tempo de medições para decair corretamente para o momento de aquisição de PET para todos os camundongos (ou seja, calcular a atividade de dose no início da varredura PET).

14. Repita para os valores residuais e subtraia da dose corrigida de decaimento para calcular a atividade exata que cada animal recebeu.

15. Depois de aplicar essa correção de decaimento, aplique também a correção padrão para garantir que os dados estejam no nível de atividade correto. Certifique-se de que essas correções sejam aplicadas aos resultados de ROI desenhados manualmente e às regiões cerebrais relevantes dos dados de ROI do atlas cerebral para a localização do dMCAO (ou seja, córtex, hipocampo e estriado).

16. Calcule o %ID/g para todas as ROIs usando a seguinte equação: %ID/g = (radioatividade ROI em nCi/cc / dose corrigida de decaimento recebida em nCi/cc) x100. Plote %ID/g em função do tempo usando um software gráfico para gerar curvas de atividade de tempo para cada ROI.

17. Use o software do scanner para visualização final da imagem e geração de figuras. Normalize as imagens de acordo com a dose corrigida de decaimento recebida por cada camundongo no momento da varredura, garantindo que todas as imagens estejam na mesma escala de %ID/g.

NOTA: Isso é necessário para permitir uma comparação precisa de imagens de diferentes camundongos e/ou imagens de estudos realizados em dias diferentes.

Resultados

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Inveon PET/CT	Siemens	Versão 4.2
software VivoQuant	InVicro	Version 2.5	Software de análise de imagem
Software Inveon Research Workspace	Siemens	Versão 4.2	Software operacional do scanner. Inclui microQView, o software de gerenciamento de pós-processamento
Dose-calibrator	Capintech		CRC-15 PET
Typhoon phosphor imager 9410	GE Healthcare	8149-30-9410
Butterfly catheters	SAI Infusion Technologies	BFL-24	27.5 G agulha
1 seringas	BD
Seringas de insulina	BD	329461	0.5 mL seringas de insulina com agulha
20 mL	VWR	BD302831	BD Seringa Ponta Deslizante Graduada
Cola de tecido	Santa Cruz Animal Health	sc-361931	3 mL
Lâmpada de calor	Fluker	27002	5.5" lâmpada de calor de réptil com braçadeira e interruptor
0.9% de solução salina estéril	Pfizer	00409-4888-10	0,9% de cloreto de sódio para injeção, 10 mL
Folhas absorventes Chux	ThermoFisher Scientific	1420662	Estofamento absorvente descartável
Tesoura de íris	World Precision Instruments	503708-12	11.5cm, Reta, pacote com 12
Fita cirúrgica	3M Durapore	1538-0	1/2"X10 yard roll, seda, hipoalergênico
Mouse PET	In house		4 mouse PET bed
Lighter	Bic	UDP2WMDC
Isoflurane	Henry Schein	NDC 11695-6776-2	Isothesia, inalação anestésica, 250 mL
Oxygen	Praxiar	UN1072	Compressed gas
Lubrificante ocular	Watson Rugby	PV926977	Artificial Tears Lubricant Eye Pomada de Lágrimas, 1/8 oz

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