Monitoramento morfológico e fisiológico de esferoides tumorais por meio de tomografia de coerência óptica

Resumo

Source: <a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/59020/longitudinal-morphological-physiological-monitoring-three-dimensional'>Huang, Y. et. al., Monitoramento morfológico e fisiológico longitudinal de esferoides tumorais tridimensionais usando tomografia de coerência óptica. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra o uso da tomografia de coerência óptica (OCT) para monitorar esferoides tumorais em uma placa de vários poços, capturando imagens transversais de alta resolução. Ao analisar os reflexos de luz das estruturas celulares, a OCT constrói modelos 3D para avaliar características morfológicas, como tamanho e forma, ao mesmo tempo em que distingue células viáveis de não viáveis com base nas mudanças de dispersão de luz ao longo do tempo.

Protocolo

1. Preparação de células

1. Obtenha linhagens celulares de um fornecedor qualificado.
   NOTA: Verifique se as células das linhas celulares de interesse podem formar esferóides nos meios de cultura ou com a ajuda de um substrato (matriz de membrana basal como Matrigel). Examine a literatura ou faça uma rodada de um pré-experimento para uma verificação.
2. Descongele as células congeladas seguindo o procedimento específico fornecido pelo fornecedor da linha celular. Um procedimento geral pode ser encontrado em outro lugar.
3. Cultive as células por 1-2 passagens em frascos de cultura de 25 cm{TAG_37}}². As células estão então prontas para uso em cultura de células 3D.
4. Monitore o estado de saúde das células diariamente e mantenha-as em uma incubadora em condições padrão (37 °C, 5% CO₂{TAG_52}}, 95% de umidade). Atualize a mídia conforme necessário.
   NOTA: O meio de cultura consiste em meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (4,5 g/L de glicose), 1% antibiótico-antimicótico e 10% soro fetal bovino (FBS). Subcultura de células antes de atingirem a confluência no frasco de cultura. Siga as diretrizes de cultura de células fornecidas pelo fornecedor. Um procedimento geral pode ser encontrado em outro lugar.
5. Realize a cultura de células 3D em placas de vários poços com base no seguinte protocolo geral.
   1. Retirar os meios de cultura do balão de cultura e lavá-los com solução salina tamponada com fosfato esterilizado (PBS, aquecida a 37 °C).
   2. Ressuspenda as células adicionando 1 mL de ácido etilenodiaminotetracético de tripsina (EDTA, 0,5%) no frasco por 3 min. Em seguida, adicione meios de cultura para diluir a tripsina.
   3. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugue por 5 min a 500 x g e temperatura ambiente.
   4. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células com 4 mL de meio de cultura pré-aquecido. Pipete uma gota da amostra em um hemocitômetro para contagem de células para determinar a concentração celular. Dilua as células até a concentração apropriada para a semeadura (}, por exemplo, {TAG_104}}, 3.000 células/mL).
      NOTA: Otimize a concentração inicial de células do esferóide para cada linha celular e cada tipo de placa de vários poços (96 poços, 384 poços ou 1536 poços).
   5. Semeie células em uma placa de vários poços de fundo redondo de fixação ultrabaixa (ULA). Adicione 200 μL de suspensão celular em cada poço a uma concentração de 3.000 células/mL para que cada poço tenha cerca de 600 células.
   6. À temperatura ambiente (RT), centrifugue toda a placa usando um adaptador de placa por 7 min, logo após a semeadura, a uma velocidade de 350 x g ou a velocidade mais baixa disponível.
      NOTA: A centrífuga ajuda a reunir as células no centro do poço para facilitar a formação de um esferóide único e uniforme. A etapa de centrifugação é realizada apenas uma vez no início para formar os esferóides tumorais. Não será repetido quando os esferóides tumorais começarem a crescer.
   7. Manter a placa de poços múltiplos a 37 °C e 5% de CO₂ numa incubadora de culturas e atualizar os meios de cultura de 3 em 3 dias.
      NOTA: O tempo de crescimento pode variar para diferentes condições de cultura 3D. Em nosso estudo, 3.000 células/mL são usadas para linhagens celulares U-87 MG e HCT 116 em placas de 96 poços, de modo que o esferóide pode crescer até ~500 μm em 4 a 7 dias para células HCT 116. Com base no protocolo geral de cultura 3D, considere adicionar suplementos de mídia e fatores de crescimento para diferentes modelos de esferoides.
   8. Realize imagens de tomografia de coerência óptica (OCT) de esferoides tumorais a cada 3 a 4 dias para um estudo longitudinal de seu crescimento.
      NOTA: Os pontos de tempo recomendados para imagens de OCT são dia 4, dia 7, dia 11, dia 14, dia 18 e dia 21.

2. Plataforma de imagem OCT de alto rendimento

NOTA:} Consulte Figura 1 para obter detalhes sobre o sistema de imagem OCT personalizado usado neste estudo.

1. Escolha uma fonte de luz de banda larga apropriada para o sistema OCT para imagens de esferóides tumorais.
   NOTA: Aqui, um diodo superluminescente (SLD, Figura 1A, B) com um comprimento de onda central de ~1.320 nm e uma largura de banda de 110 nm foi usado como fonte de luz de banda larga.
2. Construa o braço de referência e o braço de amostra do sistema OCT seguindo os esquemas (consulte Figura 1A, B para obter detalhes). A tabela Table {{TAG_258 TAG_259}}}{{}}} Materials lista os componentes ópticos necessários para construir o sistema OCT. Certifique-se de que os comprimentos do caminho óptico do braço de referência e do braço de amostra correspondam bem.
3. Construa o espectrômetro, incluindo um colimador, uma grade, uma lente F-theta e uma câmera de varredura de linha (consulte Figura 1C para obter detalhes sobre o design do espectrômetro da OCT. Como alternativa, selecione um espectrômetro comercial que corresponda ao comprimento de onda central da fonte de luz. Certifique-se de que o espectrômetro esteja alinhado corretamente para cobrir toda a largura de banda do laser, para obter alta eficiência de coleta de fótons e para fornecer lavagem lenta do padrão de interferência.
4. Caracterize o desempenho do sistema OCT, incluindo as seguintes métricas, como potência do braço da amostra, profundidade total da imagem, sensibilidade dependente da profundidade, resolução axial, profundidade de foco e resolução lateral. Coloque um refletor fraco (, por exemplo, , um espelho com um filtro de densidade neutra) como amostra para medir a sensibilidade dependente da profundidade, a resolução axial e a profundidade do foco. Coloque um alvo de gráfico de teste de resolução da Força Aérea dos Estados Unidos (USAF) como amostra para verificar a resolução lateral.
5. Selecione um estágio de translação motorizado para fornecer movimento horizontal da placa de vários poços para obter imagens de esferoides tumorais em diferentes poços (consulte Figura 1B). Use uma platina com uma faixa de deslocamento maior que 108 mm x 72 mm para garantir uma varredura completa de todos os poços da placa de vários poços. Use um estágio de tradução motorizado bidimensional (2D) ou tridimensional (3D) com controle de software para permitir a localização precisa de cada poço e a automação do sistema OCT para imagens de alto rendimento.
6. Use um adaptador de placa ou projete um suporte de placa (por impressão 3D) para manter a placa de vários poços em uma posição fixa.
7. Antes de realizar qualquer imagem OCT, corrija a inclinação e rotação da placa de vários poços usando um estágio de inclinação 2D e um estágio de rotação montados no estágio de translação (consulte Figura 1D) para minimizar a variação do plano de foco de diferentes poços. Use D2, D11, B6, D6 e G6 como poços de orientação ao monitorar suas posições relativas nas imagens OCT (Figura 1A{TAG_333}}).
8. Ajuste a rotação da placa para garantir que as bordas estejam paralelas à direção do movimento da platina, de modo que os poços permaneçam nas mesmas posições horizontais nas imagens OCT (Figura 1E). Ajuste a inclinação da placa para ficar paralela à mesa óptica para que os poços permaneçam nos mesmos locais verticais para imagens OCT ({TAG_347}}Figura 1F).
   NOTA: O ajuste do ângulo de inclinação e do foco ajuda a otimizar a qualidade da imagem OCT para todos os poços. No entanto, variações da altura dos meios de cultura em diferentes poços podem causar alterações no trajeto óptico, o que pode levar à desfocagem da imagem do esferóide. O foco automático pode ser implementado para controlar o plano focal da imagem OCT para obter uma qualidade de imagem otimizada. A etapa de ajuste não resolve a baixa qualidade da imagem OCT do esferóide tumoral devido aos seguintes problemas: descentramento do esferoide devido ao local de semeadura inicial; elevação esferóide quando incorporada em matrizes extracelulares biofabricadas; má qualidade da placa com grandes variações da altura dos fundos dos poços. Controle de software adicional com funções de foco automático ou autoalinhamento pode ser implementado para otimizar o desempenho do sistema de imagem OCT.
9. Para coletar dados de cada poço sequencialmente, um programa de computador personalizado controla a aquisição da imagem OCT e o movimento do palco.

3. OCT Digitalização e Processamento de Esferoides Tutumorais

1. No dia da imagem OCT de esferoides tumorais, remova a placa de vários poços da incubadora. Transfira-o para o sistema de imagem OCT e coloque-o em cima do adaptador de placa.
   NOTA: A imagem OCT de esferoides tumorais pode ser realizada com a tampa da placa de poliestireno ligada ou desligada. No entanto, as condensações de água na tampa devido à evaporação dos poços podem afetar a transmissão de luz e distorcer o caminho da luz, produzindo imagens de OCT menos ideais dos esferoides.
2. Ajuste a altura da placa movendo-se ao longo da direção z do estágio de translação. Mantenha a posição do plano focal em ~ 100–200 μm abaixo da superfície superior de cada esferóide, para minimizar o efeito do perfil focal de profundidade não uniforme.
3. No software personalizado, defina uma faixa de varredura OCT adequada (, por exemplo, 1 mm x 1 mm) para cobrir todo o esferóide tumoral de acordo com seus estágios de desenvolvimento. Clique em Salvar parâmetros para salvar a configuração.
4. Use o software personalizado para adquirir imagens 3D OCT de esferoides tumorais, um por um, para todos os poços da placa contendo esferoides. Clique no botão Visualizar para exibir a imagem de visualização e clique no botão Adquirir para adquirir a imagem de OCT.
   NOTA: Certifique-se de que os dados do esferoide da OCT sejam coletados quando o estágio não estiver em movimento. O esferóide geralmente está localizado no centro do poço do fundo em U. No entanto, o esferóide pode ser deslocado no meio de cultura quando o estágio está acelerando ou desacelerando devido à inércia do esferóide no meio de cultura.
5. Processe conjuntos de dados OCT 3D de esferoides tumorais para gerar imagens estruturais OCT com um código de processamento C++ personalizado. Consulte Figura 2A para obter um fluxograma do pós-processamento de dados da OCT.
   NOTA: Consulte Figura 3A para obter as imagens estruturais da OCT 3D geradas.
   1. Calibre o tamanho do pixel em todas as três dimensões. Redimensione as imagens estruturais da OCT em escalas corrigidas.
      NOTA: A distância na direção axial (direção z) das imagens OCT mede a diferença do caminho óptico entre o braço de referência e o braço de amostra. Assim, o índice de refração da amostra (n) precisa ser levado em consideração ao calibrar o tamanho do pixel na direção axial para redimensionamento. Em nosso estudo, usamos n = 1,37 como índice de refração do esferóide tumoral.
6. Gere uma colagem de imagens de esferoides usando imagens OCT 2D em três planos XY, XZ e YZ de seção transversal ao longo do centróide do esferoide. Veja Figura 4C–E para a saída representativa de colagens de imagens esferóides. Execute o registro de imagem para todos os esferoides, usando a função MATLAB dftregistration, para garantir que os centróides de todos os esferoides estejam localizados aproximadamente no mesmo local.
7. Obtenha uma renderização 3D do esferóide usando software comercial ou personalizado.
   NOTA: As etapas a seguir mostram como obter a renderização 3D de esferoides tumorais usando software comercial.
   1. Carregue os dados 3D OCT no software.
   2. Clique no painel Surpass. Em seguida, clique em Adicionar novo volume. Escolha o modo Blend a ser usado para renderização 3D.
   3. Ajuste o ângulo de visão arrastando a imagem usando o ponteiro do mouse.

4. Quantificação morfológica de esferoides tumorais 3D

NOTA: Um código escrito sob medida no MATLAB processa essa quantificação. Clique no botão Executar para iniciar o processo. Veja Figura 2B para o fluxograma das etapas de quantificação morfológica de esferoides.

1. Quantifique o diâmetro, a altura e o volume baseado no diâmetro do esferoide.
   1. Selecione imagens OCT 2D em três planos XY, XZ e YZ de seção transversal que cruzam o centróide do esferoide.
   2. Meça o diâmetro e a altura do esferóide nos planos XY e XZ, respectivamente.
   3. Calcule o volume esferóide baseado no diâmetro usando:

, com uma presunção da forma esférica do tumor.

2. Quantifique o volume esferóide baseado em voxel.
   1. Aplique um filtro de média 3D nos dados estruturais da OCT do esferoide para remover manchas.
   2. Segmente os esferoides tumorais usando o filtro de detecção de borda Canny, quadro a quadro, com um limite adequado separando a região esferóide do tumor do fundo do poço.
   3. Agrupe voxels conectivos para dados 3D (consulte a função integrada: bwconncomp).
   4. Calcule a distância média entre cada voxel conjuntivo do grupo e o centróide esferóide (escolhido manualmente), para cada grupo. Identifique a região esferóide como o grupo com a distância média mínima.
   5. Conte o número de voxels dentro da região esferóide e, em seguida, multiplique pelo volume real de um voxel individual (volume/voxel), produzindo o volume total do esferoide.

5. Detecção de região de células mortas de esferoides tumorais 3D

NOTA:} Em um meio homogêneo, a intensidade retroespalhada da OCT detectada em função da profundidade (I({TAG_686}}z)) pode ser descrita pelo Lei de Beer-Lambert:

Onde z representa a profundidade, μ é o coeficiente de atenuação óptica, e I0 é a intensidade incidente para a amostra. Portanto, o coeficiente de atenuação óptica derivado pode ser expresso como:

Como as imagens OCT são frequentemente plotadas em uma escala logarítmica, a inclinação do perfil de intensidade OCT pode ser recuperada para derivar o coeficiente de atenuação óptica. Veja Figura 2C para um fluxograma da geração dos mapas de atenuação óptica.

1. Execute a segmentação para remover regiões indesejadas fora do esferoide. Execute um filtro médio 3D para suprimir o ruído de manchas inerente às imagens OCT.
2. Obtenha coeficientes de atenuação óptica em pixels ajustando linearmente o perfil de intensidade OCT em escala logarítmica em uma determinada faixa de profundidade (janela móvel), extraindo sua inclinação e multiplicando a inclinação por -1/2.
   NOTA: O coeficiente de atenuação em cada voxel dentro da região esferóide segmentada é calculado com base na inclinação do perfil de intensidade da OCT em uma janela de profundidade de 10 voxels (~40 μm de profundidade), com o voxel localizado no meio da janela.
3. Aplique os métodos acima (etapas 5.1 e 5.2) a cada varredura axial em um quadro e a cada quadro em um conjunto de dados 3D contendo a região esferóide segmentada até que os coeficientes de atenuação óptica para todos os voxels da região esferóide segmentada sejam calculados.
4. Execute o limite binário para realçar a região de alta atenuação.
   Realce o mapa de atenuação óptica binarizado na imagem original para rotular a região de células mortas (mistura). Gere a imagem renderizada em 3D do mapa de atenuação combinada para visualizar a distribuição 3D da região da célula morta.

Resultados

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema de imagem OCT de domínio espectral personalizado			Desenvolvido em nosso laboratório
}Diodo superluminescente (SLD)	Thorlabs	SLD1325	Fonte de luz
2×2 acoplador de fibra fundida monomodo, 50:50:50 50 taxa de divisão	AC Photonics	WP13500202B201
Braço de referência
Tubo de lente	Thorlabs
Thorlabs
Lente de colimação	Thorlabs	AC080-02 0-C
Lente de focagem	Thorlabs
Thorlabs
Mirror	Thorlabs
Thorlabs
Thorlabs
Poste pedatrial	Thorlabs
Garfo de fixação	Thorlabs
Braço de amostra
Tubo de lente	Thorlabs
Adaptador	Thorlabs
Lente colimadora	Thorlabs	AC080-020-C
Galvanômetro	Thorlabs{TAG_195{}} }}
Lente de relé	Thorlabs	AC254-100-C	Lente de dois relé para fazer um telescópio setup
Montagem de espelho triangular	Thorlabs
Mirror	Thorlabs
Objetivo	Mitutoyo		{{ TAG_239}}
Poste de pedestal	Thorlabs
Garfo de fixação
Controlador de polarização	Thorlabs		{{ TAG_269}}
Montagem de gaiola de 30 mm	Thorlabs
Vara de gaiola	Thorlabs
Stage			{{ TAG_299}}
Estágio de tradução motorizado 3D	Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.	JTH360XY
2D Estágio de inclinação		}	}
Estágio de rotação	{{TAG_ 325}}
Suporte de placa			Impresso em 3D
Espectrômetro
Tubo de lente	Thorlabs{{TAG_ 355}}
Adaptador	Thorlabs
Lente colimadora	Thorlabs	AC080-020-C
Grade	Wasatch	G = 1145 lpmm
Lente F-theta	Thorlabs	FTH-1064-100
Câmera de varredura de linha InGaAs	Sensor Ilimitado	SU1024-LDH2
Componente de Cultura de Células{{TAG_ 414}}
HCT 116 Linha celular	ATCC	CCL-247
Frasco de cultura de células	SPL Life Sciences	70025
Pipeta	Fisherbrand	14388100
Pontas de pipeta	Sorenson Bioscience	10340
Gibco GlutaMax DMEM	Thermo Fisher Scientific	10569044
Soro fetal bovino, certificado, origem americana	Thermo Fisher Scientific	16000044
Antibiotico-antimicótico (100X)	Thermo Fisher Scientific	15240062
Acessório ultrabaixo de fundo redondo transparente de 96 poços Corning microplaca	Corning	7007
Gibco PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010023
Gibco Tripsina-EDTA (0,5%)	Thermo Fisher Scientific	15400054
Forma Série II 3110 Incubadora de CO2} incubadora	Thermo Fisher Scientific	3120
Luvas	VWR	89428-750
Parafilm	Sigma-Aldrich{{ TAG_555}}	P7793
Pipetas de transferência	Globe Scientific	138080	{{TAG_569 }}
Centrífuga	Eppendorf	5702 R	Para centrifugar o tubo de 15 mL
Centrífuga{{ TAG_583}}	NUAIRE	AWEL CF 48-R	Para centrifugar a placa de 96 poços
Microscópio	Olympus
Lista de PTU Comerciais
Sistema SD-OCT	Thorlabs	Série Telesto
Wasatch Photonics	WP OUT 1300 nm
Software para Análise de Dados{{TAG_ 637}}
Análise Básica de Imagens	NIH	ImageJ	Fiji também funciona.
Renderização 3D	Thermo Fisher Scientific	Amira	Software comercial. Opção 1
Renderização 3D	Bitplane	Imaris	Software comercial. Opção 2. Usado no protocolo
Software de aquisição OCT			desenvolvido sob medida em C++.
Controle de palco	Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.	MRC_3	Incorporado ao código de aquisição de OCT personalizado
Software de processamento de OCT			Desenvolvido sob medida em C++. Utilize GPU. Incorporado ao código de aquisição personalizado da OCT.
Análise Morfológica e Fisiológica			Desenvolvido sob medida em MATLAB

{{ TAG_62}}Adaptador{{TAG_ 92}}Montagem de espelho cinemático{TAG_112}}1D Estágio Translacional{{ TAG_122}}Filtro de densidade neutra contínua{TAG_136{ }} {{ TAG_151}}{TAG_166{ }} {{TAG_ 181}}{{TAG_254{ }}Thorlabs{TAG_331}}{{TAG_340} }{{{TAG_ 386}} {{TAG_400 }}{TAG_422}}{TAG_432}}{{TAG_ 473}}{TAG_520}} {{TAG_540 }}{{ TAG_610}} {TAG_624}} Sistema SD-OCT