Imagem de polissomos isolados de um cérebro de camundongo usando microscopia de força atômica

Abstract

Fonte: Lunelli, L., et. al. Examinando polissomos cerebrais com microscopia de força atômica. J. Vis. Exp.(2016).

Este vídeo demonstra a imagem de polissomos usando microscopia de força atômica. Uma folha de mica revestida de íons de níquel ancora o RNA com ribossomos anexados. A amostra é lavada, seca e montada no estágio do microscópio. A ponta cantilever varre a superfície da amostra, registrando deflexões do laser para mapear a topologia. O software é usado para corrigir distorções e visualizar estruturas polissômicas de alta resolução.

Protocol

Cuidado: Para evitar qualquer degradação de RNA das amostras, prepare todos os tampões usando água tratada com DEPC para minimizar a contaminação por RNase.

1. Preparação de polissomos de cérebros inteiros

1. Coleta de tecidos cerebrais (15 min)
   1. Eutanasiar a cepa de camundongo do tipo selvagem C57BL/6 com CO₂{TAG_35}}} por 5 min. Disseque cuidadosamente o cérebro do crânio, coloque o tecido em um tubo de 1,5 ml e coloque-o imediatamente em nitrogênio líquido. Conservar a -80 °C até à utilização.
2. Preparação de lisado (30 min)
   1. Pulverize todo o tecido cerebral usando um almofariz e pilão sob nitrogênio líquido.
   2. Transfira cerca de 25 mg de pó para um tubo de microcentrífuga frio e imediatamente (para evitar o descongelamento do tecido pulverizado) adicione 0,8 ml de tampão de lise (ver Tabela 1) e interrompa a célula pipetando para cima e para baixo 25 vezes rapidamente.
   3. Centrifugue o tubo a 12.000 x g por 1 min a 4 ° C para granular os detritos celulares.
   4. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga e mantenha o tubo no gelo por 15 min.
   5. Centrifugue o tubo a 12.000 x g por 5 min a 4 °C para granular núcleos e mitocôndrias.
   6. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga.
   7. Conservar o sobrenadante a –80 °C durante um máximo de 6 meses ou utilizá-lo imediatamente.
3. Preparação e centrifugação do gradiente de sacarose (2 horas e 30 min)
   1. Lave extensivamente os tubos da ultracentrífuga com água livre de RNase (água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC-água) ou comercial) e 3% de H₂O₂/DEPC H{TAG_125}}2{{TAG_ 126}}O solução.
   2. Coloque os tubos no gelo e adicione 5,5 ml de solução fria de sacarose a 50% no fundo de cada tubo (consulte Tabela 1 para soluções de sacarose). Adicione cuidadosamente a solução de sacarose a 15% gota a gota, mantendo-se próximo à interfase para preservar uma interfase acentuada até que o tubo esteja completamente cheio. Quando o tubo estiver completamente cheio, feche-o com uma rolha de borracha para evitar a formação de bolhas de ar.
   3. Em uma câmara fria, coloque suavemente os tubos horizontalmente e mantenha-os nessa posição por 2 horas. Após esse tempo, endireite lentamente os tubos de volta à posição vertical e coloque-os no gelo. Os gradientes agora estão prontos para serem usados. Como alternativa, prepare o gradiente de sacarose de 15-50% usando um formador de gradiente convencional.
   4. Em uma câmara fria, remova cuidadosamente 1,0 ml do topo do gradiente e cubra a sacarose gota a gota com o lisado citosólico (ou seja, o sobrenadante obtido na etapa 1.2).
   5. Abaixe cuidadosamente os tubos nos baldes do rotor da caçamba oscilante. Centrifugue os gradientes por 100 min a 180.000 x g a 4 °C usando uma ultracentrífuga.
   6. Após a centrifugação, deixe os tubos em seus baldes por 20 min a 4 °C para estabilizar os gradientes.
4. Fracionamento do gradiente de sacarose (2 horas)
   1. Remova cuidadosamente um tubo de ultracentrífuga do rotor da ultracentrífuga e monte-o no dispositivo coletor de um sistema de fracionamento de gradiente de densidade. Recolher fracções de 1 ml para monitorizar a absorvância a 260 nm com um detector UV/VIS (ver Figura 1 painel superior). Mantenha as frações coletadas no gelo.
   2. Preparar alíquotas de 30-40 μl das fracções requeridas. Mantenha-os no gelo antes de os guardar a -80 °C até à utilização. Não use alíquotas ou frações de sacarose que tenham sofrido mais de dois ciclos de congelamento e descongelamento (consulte Figura 1 painel inferior).

2. Preparação de amostras para microscopia de força atômica (3 horas)

1. Usando fita adesiva, retire as folhas de mica.
2. Lave as folhas de mica 3-4 vezes com água DEPC e coloque-as em uma pequena placa de Petri. Em seguida, seque a superfície com ar.
3. Cobrir a mica com 200 μl de 1 mM de NiSO₄ e incubar durante 3 min a RT.
4. {TAG_231}}Eliminar a solução de níquel e secar a superfície com ar. Execute todas as etapas futuras a 4 ° C colocando a placa de Petri com a mica no gelo.
5. Descongelar uma alíquota obtida em 1.4.2 sobre gelo e adicionar delicadamente toda a amostra, gota a gota, à mica. Usando uma ponta de 100-200 μl, espalhe a amostra em toda a superfície da mica. Incubar a amostra no gelo durante 3 min.
6. Cobrir a folha de mica gota a gota com 200 μl de Buffer-AFM frio (ver Tabela 1) e incubar durante 1 hora no gelo.
7. Imagem em líquido
   1. Remova cuidadosamente o microscópio de força atômica (AFM) e lave as folhas de mica 3-4 vezes com 200 μl de Buffer-AFM frio para remover o excesso de sacarose. Em seguida, lave as folhas de mica 3 vezes com uma solução de lavagem fria (ver Tabela 1), deixando a superfície da mica coberta por alguns microlitros de solução.
   2. Vá para o ponto 3 (Aquisição de imagem).
8. Imagem no ar
   1. Remova cuidadosamente o Buffer-AFM e lave a mica 3-4 vezes com 200 μl de Buffer-AFM frio para remover o excesso de sacarose. Em seguida, lave a mica 3 vezes com solução de lavagem fria (consulte Tabela 1) e escorra o excesso de água usando papel.
   2. Deixar a amostra secar sob a cobertura química com a parte superior da placa de Petri parcialmente aberta. Após 2 horas, feche a placa de Petri e guarde-a em temperatura ambiente (RT). Meça a amostra após 2-3 horas, pois elas são estáveis por anos.

3. Aquisição de imagem (15 min por imagem após estabilização térmica)

Nota: Os polissomos imobilizados na mica podem ser fotografados no ar ou no líquido usando o modo AC.

1. Prenda a mica ao porta-amostras usando fita dupla-face.
2. Insira o porta-amostras no estágio AFM seguindo as instruções do fabricante. Ao obter imagens em líquido, se possível, tente manter a amostra a uma temperatura inferior a 25 °C para aumentar a estabilidade do polissomo no tempo.
3. Selecione um cantilever adequado para imagens CA e monte-o no suporte da ponta seguindo as instruções do fabricante. Aqui, use cantilevers com uma constante de força entre 2-20 N/m para imagens de ar e cerca de 0,1 N/m para imagens líquidas.
4. Ajuste o ponto do laser no cantilever e zere os sinais do detector de quadrantes.
5. Selecione uma frequência de condução oportuna e acione o cantilever com uma amplitude de 10-20 nm.
6. Aproxime-se da amostra até que a ponta se encaixe na superfície.
7. Selecione uma área de varredura de 2x2 μm, adquira pelo menos 512x512 imagens de pixel (largura de pixel < 4 nm) e selecione um modo de subtração de fundo ao vivo e uma escala Z de 20-25 nm.
8. Inspecione a imagem procurando a presença de objetos redondos caracterizados pela altura entre 10 e 15 nm ao adquirir no ar e 25 e 30 nm quando no líquido e a largura na faixa de 25-30 nm. Ajuste o ponto de ajuste e os parâmetros de feedback até que objetos pontiagudos sejam visualizados. O fundo deve parecer relativamente plano em boas amostras, com alguns objetos de altura de 2-4 nm (consulte Figura 2A e B{TAG_382}}).
9. Se a imagem parecer boa (como indicado no ponto 3.8), adquira várias (pelo menos dez) varreduras de 2x2 mícrons em diferentes áreas de amostragem.
10. (opcional). Se necessário, adquira imagens de alta resolução de polissomos selecionados (consulte Figura 2C{TAG_400}}).
11. Aplique correções de software (subtração plana e algoritmos de correção linha a linha) para corrigir as imagens AFM, removendo efeitos arbitrários de inclinação e desvio.

4. Análise de dados (30 min por imagem)

1. Exporte imagens em ImageJ (opcional: aplique um fator de escala) preferencialmente usando um formato de compactação sem perdas, por exemplo, o formato TIFF (ver Figura 3A).
2. Use o conjunto de ferramentas de macro ImageJ RiboPick.ijm (a ser copiado no subdiretório macro/conjunto de ferramentas ImageJ) para contar ribossomos em polissomos (consulte Figura 3B) e calcule as propriedades estatísticas da amostra (consulte Figura 3C).
   1. Comece a carregar uma imagem usando a ferramenta que inicializa o programa.
   2. Escolha os centros dos ribossomos com a ferramenta padrão ImageJ (shift + clique esquerdo permite a seleção múltipla de ribossomos). Marque os ribossomos selecionados com a ferramenta . As coordenadas do ribossomo aparecerão em uma janela de texto personalizada.
   3. Adicionar mais ribossomas ao mesmo polissoma, repetindo o procedimento indicado no ponto 4.2.2.
   4. Remova os ribossomos marcados incorretamente usando a ferramenta (comece a remover do último ribossomo adicionado ao primeiro - apenas no polissomo atual).
   5. Quando o polissomo estiver concluído, use a ferramenta . À medida que o número de polissomas é adicionado como uma sobreposição à imagem, a janela de texto é atualizada.
   6. Use o para escrever o arquivo de coordenadas do ribossomo (as unidades padrão da imagem são usadas) e uma imagem PNG que resuma os ribossomos e polissomos escolhidos. A imagem original é fechada sem ser salva.

Tabela 1. Buffers.

10 mM Tris-HCl, pH 7.000 5

3% (p/v) sacarose

pH = 7.4

Buffer	Composição	} Aplicativo
Buffer de lise	Preparação de lisado (1.1)
	10 mM NaCl	{{TAG_ 577}}
	10 mM MgCl2{TAG_590}}
	1% Triton-X100
	1% Na-desoxicolato
	{TAG_629}}0.4 U/ml de inibidor de RNase
{{ TAG_641}}	1 mM DTT
	0.2 mg/ml de cicloheximida
	{{ TAG_673}}5 u/ml Dnase i
50% solução de sacarose{{TAG_687 }}	50% (p/v) de sacarose em	Sacarose preparação do gradiente (1.2)
	100 mM NaCl {{TAG_717 }}
	10 mM MgCl2{{ TAG_733}}
	10 mM Tris/HCl pH 7.5
{{TAG_757 TAG_758}}	{{ TAG_764}}15% (p/v) de sacarose em	Preparação de gradiente de sacarose (1.} 2)
	100 mM NaCl
10 mM MgCl2
	10 mM Tris/HCl pH 7.00 5
Solução de níquel	{TAG_835}}1 mM NiSO4	{TAG_851}}Preparação de amostras para AFM (2)
Buffer-AFM	100 mM NaCl	Preparação de amostras para AFM (2)
	10 mM MgCl2
	100 μg/ml de cicloheximida{{}}{{}{{}}} TAG_908 5}}
	10 mM Hepes{{ TAG_924}}
Lavagem Solução	DEPC-Water	{TAG_969}}Preparação de amostra para AFM ( 2)
	100 μg/ml de cicloheximida {{ TAG_985}}

{{ TAG_548}}} {{ TAG_610}}{TAG_680}}{ TAG_794}} {{ TAG_824}}{TAG_883}}{TAG_932}}

Results

Materials