$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
<
p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;text-align:justify;' dir='ltr'>
Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE. 1. Preparação de amostra para exames de microtomografia computadorizada (TC)
- Eutanasiar filhotes neonatais em P8 por asfixia por dióxido de carbono.
- Realize a perfusão intracardíaca inserindo uma agulha de calibre 29 com 3 mL de paraformaldeído a 2% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) em uma seringa de 10 mL no ventrículo do coração do camundongo.
CAUTION: O paraformaldeído é tóxico; Use proteção adequada. - Separe a cabeça do corpo usando uma tesoura. Remova toda a pele da cabeça usando uma tesoura e retire o crânio usando uma pinça para dissecar todo o cérebro.
- Tire imagens do cérebro com um estereomicroscópio com ampliação de 7,82x, ganho de 1x, gama de 0,6 e tempo de exposição de 20 ms.
- Fixe os cérebros dissecados com paraformaldeído a 4% em solução de PBS durante a noite.
CAUTION: O paraformaldeído é tóxico; Use proteção adequada. - No dia seguinte, retire os rombencéfalos usando uma pinça e lave com a solução de PBS.
- Incube os rombencéfalos na solução de iodo de Lugol por 48 h.
- Após a incubação, seque brevemente o rombencéfalo para remover o excesso de solução de iodo de Lugol.
- Embale os rombencéfalos corados com iodo de Lugol em tubos de microcentrífuga de 0,65 mL e sele completamente com filme plástico de parafina para evitar o encolhimento do tecido (Figura 1A).
- Coloque os tubos de microcentrífuga em tubos de plástico de 5 mL com esponjas para evitar que eles se movam durante a varredura (Figura 1B).
2. Micro-CT Scan de malformações cavernosas cerebrais (CCMs) no cérebro do camundongo
- Monte verticalmente o rombencéfalo embalado em um tubo em um suporte de alumínio no sistema micro-CT.
- Defina os parâmetros de varredura para 540 projeções e tempo de exposição de 2 s com condições de fonte de 50 kV e 10 W para adquirir os conjuntos de dados tomográficos (resolução de imagem de 9,5 μm/pixel).
- As radiografias da varredura são reconstruídas automaticamente pelo software de reconstrução de projeção baseado em hardware fornecido pelo sistema de micro-CT, produzindo uma série de imagens de cortes axiais de 16 bits (arquivo "TXM").
3. Análise de conjuntos de dados Micro-CT
- Abra o arquivo de imagem reconstruído (arquivo "TXM") no software de análise 3D e visualize o cérebro usando a função "renderização de volume".
- Transforme o rombencéfalo na orientação desejada usando as funções "caixa delimitadora" e "plano de corte".
- Reamostrar a imagem transformada no modo estendido e preservar o tamanho do voxel.
- Crie "editar novo campo de rótulo" na imagem transformada (3.3) e destaque apenas o rombencéfalo usando intensidade em escala de cinza.
- Adicione as áreas destacadas e execute a "análise de rótulo" para obter medições de todo o rombencéfalo (i.e., volume total e área). Exporte medidas em um arquivo do Excel.
- Visualize o rombencéfalo usando a função "renderização de isosuperfície".
- Crie outro "editar novo campo de rótulo" na imagem transformada e destaque as áreas com lesões usando a intensidade da escala de cinza.
- Adicione as áreas destacadas e execute a análise de "rótulo" para obter medições das lesões dentro do rombencéfalo (i.e., volume total e área). Exporte medidas em um arquivo do Excel.
- Visualize as lesões usando as funções "gerar superfície" e "visão de superfície".
- Tire as imagens do rombencéfalo nas orientações desejadas ou gere um filme para visualização 3D das lesões.
