Imagem de fluorescência dupla para identificar oligodendrócitos diferenciados

Resumo

Fonte: Schott, J. T., }et al. Preparação de culturas progenitoras de oligodendrócitos de ratos e quantificação da oligodendrogênese usando varredura de fluorescência de infravermelho duplo. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra o uso de imagens de fluorescência dupla para avaliar a diferenciação de oligodendrócitos de células precursoras (OPCs) isoladas de um cérebro de filhote de rato. O processo inclui fixar as células, rotular marcadores específicos com anticorpos primários e secundários conjugados com fluoróforo e visualizá-los usando imagens de fluorescência. Oligodendrócitos diferenciados expressando tanto a proteína básica da mielina (MBP) quanto o fator de transcrição de oligodendrócitos 2 (Olig2) são identificados, distinguindo-os das células precursoras indiferenciadas que expressam apenas Olig2.

Protocolo

1. Preparação de Placas de Ensaio, Soluções de Estoque e Mídia de Base OPC

Nota:<span style='font-family:Arial,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > A base OPC de rato (Sato) Formulações de meios alternativos também podem ser compatíveis com este procedimento.

1. Ressuspenda a poli-L-lisina (PLL) a uma concentração de 10 μg/ml em água deionizada estéril. Pipetar 400 μl de PLL diluído em cada alvéolo de uma placa de 24 poços de fundo transparente de paredes pretas.
2. Cubra as placas de cultura de tecidos por 2 horas em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 °C ou durante a noite em uma geladeira a 4 °C.
3. Aspire PLL de pratos revestidos pelo menos 20 minutos antes do revestimento. Deixe o PLL restante secar do poço colocando placas de 24 poços com a tampa parcialmente entreaberta em uma capa de cultura de tecidos. Verifique se os poços estão completamente secos antes de plaquear OPCs isolados. As células não aderem ao plástico que tem PLL líquido presente.
4. Prepare N-Acetil-L-cisteína (NAC) solução estoque (1.000x): Dissolver 100 mg N-Acetil-L-cisteína (NAC) em 20 ml de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM). Alíquota e conservar a -20 °C.
5. Prepare a solução estoque de hidrocortisona (1.000x): Adicione 1 ml de etanol a 1 mg de hidrocortisona e agite para dissolver. Adicionar 19 ml de DMEM, misturar a solução, alíquota e conservar a -20 °C. A adição de hidrocortisona ao meio de base demonstrou aumentar a sobrevivência das células gliais.
6. Prepare a solução estoque de d-biotina (5.000x): Dissolva 2,5 mg de d-biotina em 50 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Adicione gotas de 1-2 x 5 μl de NaOH 0,1 N para ajudar na dissolução. Alíquota e conservar a -20 °C.
7. Prepare a solução estoque de insulina (100x): Dissolva 25 mg de insulina em 50 ml de água para cultura de tecidos. Adicionar 250 μl de HCl 1 N e misturar até a solução ficar límpida. Esterilize com um filtro de 0,22 μm e armazene a 4 °C por até 6 semanas.
8. Prepare a solução de estoque Sato (100x):
   1. Prepare a solução-mãe de progesterona (25 μg/μl): Dissolva 2,5 mg de progesterona em 100 μl de etanol.
   2. Prepare a solução-mãe de selenito de sódio (400 ng / μl): Dissolva 4 mg de selenito de sódio em 100 μl de NaOH 0,1 N. Adicionar 10 ml de DMEM e misturar.
   3. Para 100 ml de DMEM, adicione 1 g de apo-transferrina humana, 1 g de albumina de soro bovino e 160 mg de putrescina e misture para dissolver completamente. Adicione 25 μl de solução estoque de progesterona, 1.000 μl de solução estoque de selenito de sódio e misture. Alíquota e conservar a -20 °C.
9. Prepare o OPC Base Media: por 100 ml de DMEM (com 4,5 g/L de D-glicose, L-glutamina e 110 mg/L de piruvato de sódio), adicione 100 μl de NAC, 100 μl de hidrocortisona, 20 μl de d-biotina, 1 ml de insulina, 1 ml de estoque de Sato, 100 μl de oligoelementos B, 2 mL de suplemento de B-27 (50x) e 1 ml de penicilina/estreptomicina (100x). Esterilizar com um filtro de 0,22 μm e conservar a 4 °C.
10. Prepare a solução-mãe do fator de crescimento derivado de plaquetas AA (PDGF-AA) (1.000x): Dissolva 250 μg em 12,5 ml de PBS com albumina de soro bovino (BSA) a 0,1% para fazer uma solução de 20 μg/ml. Alíquota e conservar a -80 °C.
11. Preparar meios de proliferação OPC: Meios de base OPC suplementados com 20 ng/ml PDGF-AA.
12. Prepare meios de diferenciação OPC: meios de base OPC suplementados com triiodotironina 45 nM.
13. Prepare o tampão da coluna: Para 500 ml de PBS, adicione 2.5 g de BSA e 2 ml de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0.5 M e ajuste o pH para 7.2. Esterilizar com um filtro de 0,22 μm e conservar a 4 °C.

2. Indução de diferenciação e fixação de OPC com paraformaldeído a 4%

Nota:<span style='font-family:Arial,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > Ao testar o efeito de pequenas moléculas na oligodendrogênese, dissolvemos rotineiramente medicamentos em dimetilsulfóxido (DMSO) para preparar estoques de 1.000 vezes que podem ser armazenados a -80 ° C e diluídos diretamente em meio SATO para obter uma concentração final de 0,1% de DMSO. Não observamos alterações na proliferação ou diferenciação de OPC usando esta concentração de DMSO (dados não mostrados).

1. Pré-aqueça a mídia base OPC a 37 °C e descongele os estoques de tratamento medicamentoso à temperatura ambiente. Ao realizar tratamentos em duplicado, prepare aproximadamente 1,25 ml de meio por grupo de tratamento em um tubo de 1,5 ml. Para amostras triplicadas, use tubos de centrífuga com capacidade de 2 ml para compensar a folga.
2. Prepare as misturas principais de tratamento para poços replicados diluindo os estoques de tratamento diretamente no meio de base OPC. Agite brevemente ou misture suavemente cada mastermix para garantir uma distribuição homogênea do tratamento.
3. Prepare 45 nM triiodotironina (T₃) como o controle positivo e o veículo apropriado como o controle negativo. Dilua 10 mM T₃ estocar 1:1.000 em 1 ml de meio de base OPC e, em seguida, diluir ainda mais na mistura principal de tratamento para reduzir a concentração final de DMSO, se necessário.
4. Aspire o meio dos poços de cultura, um grupo de tratamento de cada vez, para evitar o ressecamento das células. Use uma ponta de pipeta de 200 μl na extremidade da pipeta de vidro Pasteur para evitar raspar o material preto das laterais do poço para dentro da cultura.
5. Adicione lentamente 500 μl de mastermix de tratamento ao longo da lateral do poço usando uma pipeta de 1 ml.
6. Incube as culturas pelo período de tempo desejado, realizando uma troca completa de meios com novos meios de tratamento a cada 2-3 dias. Observamos rotineiramente um MBP⁺ cultura após 4 dias em meios de diferenciação.
7. No final do período de tratamento desejado, prepare paraformaldeído fresco a 4% (PFA) ou descongele um caldo congelado à temperatura ambiente. CUIDADO:<span style='font-family:Arial,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > PFA é extremamente tóxico e deve ser preparado em uma hotte.
8. Aspire o meio e adicione lentamente 400 μl de PFA na lateral do poço para fixar as células. Incube a placa por 20 min em temperatura ambiente.
9. Aspire o PFA e adicione lentamente 500 μl de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco estéril (D-PBS, com Ca²⁺ e Mg²⁺) ao lado do poço para lavar as células. Repita a lavagem mais duas vezes. Não aspire a lavagem final.
10. Embrulhe a placa em parafilme e armazene a 4 °C para processamento posterior ou prossiga diretamente para a próxima etapa. As placas podem ser armazenadas por várias semanas.

3. Imunocitoquímica e Quantificação da Proteína Básica da Mielina

Nota:<span style='font-family:Arial,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' > Ao realizar procedimentos de manuseio de líquidos nas placas de 24 poços, é recomendável trabalhar rápido para evitar o ressecamento das células. Aqui, recomenda-se o uso de um aspirador a vácuo multicanal e pipeta multicanal.

1. Leve a placa à temperatura ambiente, aspire os poços e adicione 250 μl de D-PBS (com Ca²⁺ and Mg²⁺) contendo 0,1% de Triton X-100 e 5% de soro de cabra normal (NGS). Incube a placa em temperatura ambiente por 1 hora com agitação orbital suave.
2. Prepare a solução de incubação primária diluindo o anticorpo monoclonal anti-MBP de camundongo 1:1.000 e o anticorpo policlonal anti-actina de coelho 1:200 em D-PBS (com Ca²⁺ e Mg²⁺) contendo 5% NGS. Alternativamente, o anti-Olig2 policlonal de coelho a 1:1.000 pode ser usado para normalização específica de oligodendrócitos em culturas gliais mistas. Preparar solução primária suficiente para acomodar 250 μl por alvéolo.
3. Incubar anticorpos primários a 4 °C durante a noite durante 16-18 horas com agitação orbital suave.
4. Aspire a solução de incubação primária e lave as células 3 x 10 min com 500 μl de D-PBS (com Ca²⁺ e Mg²⁺) à temperatura ambiente com agitação orbital suave.
5. Enquanto lava a placa, prepare a solução de incubação secundária diluindo os anticorpos anti-rato 680 e anti-coelho 800 1:500 em D-PBS (com Ca²⁺ e Mg²⁺) contendo 5% NGS. Minimize a exposição à luz ambiente ao preparar esta solução.
6. Aspirar a lavagem final e adicionar 250 μl de solução de incubação secundária. Proteja a placa da luz e incube-a em temperatura ambiente por 1 hora com uma agitação orbital suave.
7. Aspirar a solução de incubação secundária e lavar os alvéolos 3 x 10 min com 500 μl de D-PBS (com Ca²⁺ e Mg²⁺) à temperatura ambiente com agitação orbital suave.
8. Escaneie a placa usando um sistema de imagem capaz de detectar emissões de fluorescência de 700 nm e 800 nm. Como ponto de partida, defina o deslocamento focal para 3 e as sensibilidades para 1,5 para MBP, 5,0 para Actina e 3,5 para Olig2. Ajuste os valores de sensibilidade conforme necessário para evitar a superexposição do sinal.
9. Quantificar a extensão da oligodendrogênese usando métodos semiautomatizados baseados em software.
   1. Usando o software, defina o modo de análise de placas como "24 Well" e alinhe os círculos ao redor do perímetro externo dos poços digitalizados. Defina o canal de normalização para "800" e exporte as intensidades de fluorescência total e relativa para os canais de 700 nm (MBP) e 800 nm (Olig2/Actina).
   2. Divida a intensidade em 700 nm pela intensidade em 800 nm para obter a expressão MBP normalizada em unidades de fluorescência relativa. Calcule a média das medições replicadas e dimensione a expressão para os controles do Dia 0 + PDGF conforme necessário para a análise.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Culture Materials
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	20 ng/mL
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650	Hybri-Max 100 mL
Triiodotironina	Sigma-Aldrich	T6397	45 nM
Clemastine fumarato sal	Sigma-Aldrich	SML0445-100MG	1 μM
Sal de hemifumarato de quetiapina	Sigma-Aldrich	Q3638-10MG	1 μM
N-acetilcisteína	Sigma-Aldrich	A9165	5 μg/mL
Progesterona	Sigma-Aldrich	P8783	60 ng/mL
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524	10 μg/mL
Putrecine	Sigma-Aldrich	P7505	16 μg/mL
Selenito de sódio	Sigma-Aldrich	S5261	40 ng/mL
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0135	50 ng/mL
d-Biotina	Sigma-Aldrich	B4639	10 ng/mL<
Insulin<	I6634	5 μg/mL
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1147	100 μg/mL
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	A4161	100 μg/mL
Trace Elements B	Corning	25-022-Cl	1 x
B-27 Supplement	Life Technologies	17504044	1 x
Penicilina/Streptomycin<	15140122	1 x
DMEM	Life Technologies	11995-065	1 x
24-well Black Visiplate com tampa	Perkin Elmer	1450-605	Tissue culture grade
Imunocitoquímica e Quantificação
PFA	Sigma-Aldrich	100-13A	4%
Triton X-100	Sigma-Aldrich	78787	0.10%
Normal Goat Serum	Jackson Immuno Research	005-000-121	5%
mouse monoclonal anti-MBP	Biolegend	SMI-99P	1:1000 Diluição
rabbit polyclonal polyclonal anti-Actin	Santa Cruz Biotecnology	SC-7210	1:200 Diluição
coelho policlonal anti-Olig2	Millipore	AB9610	1:1000 Diluição
goat anti-mouse 680RD	Licor	926-68070	1:500 Dilution
goat anti-rabbit 800CW	Licor	926-32211	1:500 Dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11032	1:000 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit	Life Technologies	A11008	1:000 diluição
Prolongar o antifade Gold com DAPI	Life Technologies	P36931
DPBS with Ca2+ e Mg2+	Corning	21-030-CV
Licor Odyssey Clx Infared Imaging System	Licor

tr style='height:20px;'>td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Sigma-Aldrichtd style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Life Technologies