Visualização de mitocôndrias dentro das fibras nervosas intraepidérmicas

Resumo

Fonte: Hamid, H. S., et al. Imagem tridimensional e análise de mitocôndrias dentro de fibras nervosas intraepidérmicas humanas. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra o método para visualizar mitocôndrias específicas do nervo usando imagens tridimensionais. Ele descreve o processo de aquisição de varreduras sequenciais de fibras nervosas intraepidérmicas pré-marcadas e geração de imagens de superfície 3D para isolar e exibir mitocôndrias em relação às estruturas nervosas.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Confocal Imaging

1. Execute imagens confocais:
   1. Colete imagens usando um microscópio confocal de varredura a laser com uma objetiva de imersão em óleo de 40X (1,25 abertura numérica (NA)) em um microscópio invertido.
      1. Em cada plano focal, adquira sequencialmente sinais fluorescentes:
         Núcleos: excitação λ = 405 nm, filtro de emissão espectral λ = 420 - 480 nm
         Fibras nervosas: excitação λ= 488 nm, filtro de emissão espectral λ = 505 - 560 nm
         Mitocôndrias: excitação λ = 543 nm, filtro de emissão espectral λ= 606 - 670 nm
   2. Insira os seguintes parâmetros de varredura no software do microscópio: taxa de varredura de 600 Hz com média de 2 quadros e zoom de 2,2; Resolução de intensidade de 12 bits (4096 níveis de cinza).
      1. Defina o software do microscópio para resolução lateral otimizada (resolução de varredura = 1.024 x 1.024) e resolução axial/seccionamento óptico (abertura confocal = 1 unidade arejada (AU) com tamanho de passo z de 210 nm).
         NOTA: A resolução XYZ resultante é de 172,2 nm x 172,2 nm x 210 nm com um tamanho de imagem de 176,1 μm x 176,1 μm x 30-50 μm.
   3. Ative uma varredura ao vivo para o sinal nervoso (fluorescência verde) e ajuste o controle de foco z para encontrar e definir os planos focais superior e inferior no software do microscópio que abrangem o sinal nervoso dentro da seção de tecido. A faixa z total é normalmente de 30-50 μm para uma seção de tecido de 50 μm.
   4. Gire o campo de varredura com o software do microscópio durante uma varredura ao vivo para que a epiderme fique posicionada horizontal ou verticalmente na imagem.
   5. Escaneie cada sinal separadamente e ajuste a tensão e o deslocamento do detector (tubo fotomultiplicador, PMT) para minimizar/remover quaisquer pixels saturados demais e insuficientes.
      NOTA: Os tempos de varredura com os parâmetros acima levam aproximadamente 20 a 40 minutos, dependendo do número de z-slices.

2. 3D Visualização e Análise de Mitocôndrias em Fibras Nervosas Intraepidérmicas Humanas

1. Isole a epiderme 3D:
   1. Duplique a imagem original e use a projeção de intensidade máxima (visualização de foco estendido) da imagem para identificar e isolar a epiderme.
   2. Use uma ferramenta de região de interesse para traçar ao longo das bordas superior e inferior da epiderme para remover áreas indesejadas, como o estrato córneo e a derme, que estão ausentes de fibras nervosas intraepidérmicas. Corte para esta seleção.
2. Use a deconvolução nos sinais fluorescentes nervosos e mitocondriais:
   NOTA: Deconvolução ajuda a restaurar a integridade dos sinais fluorescentes. A restauração usada neste protocolo é chamada de deconvolução cega porque usa os sinais fluorescentes nas imagens para determinar o quanto os sinais se espalham de sua fonte original (função de propagação de pontos). O processo melhora a resolução do sinal reatribuindo o sinal espalhado de volta ao seu local de origem.
   1. Calcule uma função de propagação de pontos (PSF) para o sinal nervoso fluorescente verde (fluorescência verde) com os seguintes parâmetros:
      1. Defina o PSF calculado como confocal. Defina o índice de refração médio para 1,515 e a abertura numérica para 1,25. Defina o orifício do detector para 1 UA. Defina o comprimento de onda de excitação do laser para 488 nm e o comprimento de onda de emissão para 515 nm.
   2. Calcule um PSF para o sinal mitocondrial fluorescente vermelho (fluorescência vermelha) com os seguintes parâmetros:
      1. Defina o PSF calculado como confocal. Defina o índice de refração médio para 1,515 e a abertura numérica para 1,25. Defina o orifício do detector para 1 UA. Defina o comprimento de onda de excitação do laser para 543 nm e o comprimento de onda de emissão para 617 nm.
   3. Otimize os sinais fluorescentes de nervos e mitocôndrias por deconvolução usando os PSFs correspondentes listados acima e o recurso de restauração iterativa definido com 100% de confiança e um limite de iteração de 10 ciclos.
3. Crie superfícies específicas de nervos:
   1. Use a ferramenta "criar superfície" para criar uma superfície sólida dos nervos a partir da marcação secundária verde-fluorescente deconvolvida dos nervos identificados pelo produto do gene da proteína 9.5 (PGP9.5).
   2. Desmarque o recurso "suave" e use o recurso de intensidade absoluta para definir o limite para o sinal nervoso, pois é significativamente mais brilhante que a fluorescência de fundo.
   3. Use o recurso de intensidade absoluta para definir o limite para o sinal nervoso, pois é significativamente mais brilhante do que a fluorescência de fundo. Defina o valor limite baixo o suficiente para identificar com precisão os nervos.
   4. Filtre superfícies pequenas e não nervosas com base no tamanho.
      NOTA: Se necessário, edite manualmente superfícies não nervosas adicionais na guia "Editar" segurando a tecla CONTROL para destacar vários objetos e, em seguida, excluindo-os com a tecla Delete.
4. Isole o sinal mitocondrial fluorescente específico do nervo:
   1. Selecione a guia Editar da superfície do nervo para visualizar o recurso "Propriedades da máscara". A superfície nervosa criada é usada para isolar as mitocôndrias dentro desses nervos, longe dos sinais mitocondriais associados aos queratinócitos.
   2. Como o botão "Mascarar tudo" abre uma janela "Canal de máscara", escolha o sinal vermelho-fluorescente deconvolto no menu suspenso em "Seleção de canal" para o sinal mitocondrial.
   3. Clique na caixa para marcar a opção "duplicar canal antes de aplicar a máscara".
   4. Clique no botão de opção na frente da opção "Constante dentro/fora" das Configurações de máscara e clique na caixa para marcar a opção "Definir superfície externa de voxel para" e digite 0,00 para o valor. Clique no botão OK para criar o novo canal que representa os sinais mitocondriais dentro da superfície do nervo.
5. Crie superfícies específicas de mitocôndrias:
   1. Use a ferramenta "criar superfície" para criar uma superfície sólida das mitocôndrias a partir do canal fluorescente recém-criado dos sinais mitocondriais específicos do nervo.
   2. Desmarque o recurso "suave" e selecione o recurso "subtração de fundo" para definir o limite. Esse recurso usa contraste local ao redor do sinal mitocondrial para identificar as mitocôndrias a partir do fundo.
   3. Defina o valor limite baixo o suficiente para identificar as mitocôndrias com precisão. Neste exemplo, o limite inferior foi definido em 2.000 para uma escala de 16 bits (65.536).
   4. Filtre as superfícies mitocondriais com base no tamanho. Neste exemplo, o limite de voxels foi definido como 1,0 voxels, que é o limite mais baixo possível. Se necessário, edite manualmente as superfícies não mitocôndrias na guia "Editar" segurando a tecla CONTROL para selecionar vários objetos e, em seguida, excluindo-os com a tecla Delete.
      NOTE: Ocasionalmente, o software criará superfícies que não estão associadas a um sinal mitocondrial fluorescente distinguível. Nesses casos, é possível removê-los com a guia "Editar".

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscópio confocal de varredura a laser Leica SP5	Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL	SP5
Volocity x64 software	Perkin Elmer, Waltham, MA	Version 4.4.0	O software Volocity é usado para processamento de imagem
Imaris x64 3D analysis software	Bitplane, Concord, MA	Version 7.7.1	O software Imaris é usado para análise de imagem