Imagens de cálcio ex vivo para estudar as respostas cerebrais de Drosophila a neuropeptídeos

Resumo

Source: Ishimoto, H. et. al., Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra imagens de cálcio para estudo Drosophila respostas cerebrais a neuropeptídeos. Os neurônios que expressam um indicador fluorescente de cálcio revelam a dinâmica do cálcio intracelular e as respostas funcionais às moléculas de sinalização.

Protocolo

1. Preparação de explantes cerebrais larvais

1. Faça uma câmara de imagem.
   NOTE: A gravação estável requer que os explantes cerebrais sejam amarrados. Aqui, uma câmara de imagem feita à mão de baixo custo é usada no estilo Ca²⁺ imaging system.
   1. Usando uma pinça, raspe o centro inferior de uma placa de cultura plástica (35 mm x 10 mm) para criar um dente para o gânglio ventral do cérebro larval, facilitando a montagem (etapa 1.3, Figura 1).
   2. Com um palito, coloque uma pequena gota de supercola em cada lado do amassado e prenda uma haste de tungstênio (0,125 mm de diâmetro, 6 a 7 mm de comprimento) na cola.
   3. Usando um pequeno pedaço de adesivo reutilizável semelhante a uma massa, faça uma parede circular (10 mm de diâmetro e 3 mm de altura) ao redor do amassado (Figura 1).
      NOTE: O espaço dentro da parede será posteriormente preenchido com solução salina tamponada com fosfato (PBS; cloreto de sódio 0,14 M (NaCl), cloreto de potássio 0,0027 M (KCl), íon fosfato 0,01 M (PO4^3–), pH 7,4 ± 0,05 a 25 °C).
2. Animal preparation
   NOTE: Para imagens de cálcio, um indicador de cálcio, GCaMP6s, é expresso no tipo de célula de interesse, o que é comumente obtido usando combinações de GAL4 específico do tecido e UAS-GCaMP6s. Para garantir que o sinal seja mediado pelo receptor candidato, o GCaMP6s também é expresso em um mutante defeituoso no receptor.
   1. Quando são necessárias comparações experimentais para diferentes genótipos, como tipo selvagem e mutantes, as larvas de teste de idade para evitar variações no nível de expressão de GCaMP6 e diferenças fisiológicas devido a estágios de desenvolvimento.
   2. Mantenha as moscas parentais (30 moscas para cada sexo) em um frasco de cultura contendo comida padrão para moscas por 8 horas para permitir a postura de ovos na superfície do alimento. Cultura de larvas em massa sob um ciclo claro-escuro de 12 horas a 25 °C e 60-70 % de humidade relativa.

3. Dissection of the larval brain
   1. Às 90-120 h após a postura dos ovos (AEL), colete as larvas e lave-as pelo menos 3 vezes com água destilada para remover os restos de comida aderentes.
   2. Coloque uma larva em um vidro de relógio quadrado de 1,5 polegada cheio de PBS gelado.
      NOTE: As próximas duas etapas são realizadas neste vidro de relógio sob o microscópio de dissecação.
   3. Use uma pinça para agarrar suavemente a parte do meio da larva. Use outra pinça para agarrar os ganchos da boca e puxe os ganchos da boca suavemente para separar a parte anterior da larva que contém o cérebro do resto do corpo.
      NOTA: Alternativamente, tesouras cirúrgicas podem ser usadas.
   4. Segure a ponta anterior com uma pinça e vire a larva do avesso. Remova o tecido estranho ligado ao cérebro, como discos imaginários, corpos gordurosos e glândulas anelares. Separe suavemente o cérebro das peças bucais.
   5. Aplique 200 μL de PBS no interior do anel feito do adesivo reutilizável semelhante a massa na câmara de imagem. Sugue suavemente o cérebro dissecado com PBS em uma pipeta Pasteur e, em seguida, transfira-o para a câmara de imagem.

4. Setting the brain into the imaging chamber
   1. Use fórceps para agarrar as fibras musculares que se estendem dos gânglios ventrais. Insira o cérebro suavemente no amassado embaixo do fio de tungstênio.
   2. Usando outra pinça, puxe o fio de tungstênio ligeiramente para cima para colocar o cérebro na posição correta para a imagem (Figura 1).

2. Aquisição de Ca²⁺ Fluorescence Images

OBSERVAÇÃO: Explantes cerebrais imersos em PBS são fotografados usando um microscópio de fluorescência equipado com uma lente objetiva de imersão em água de 20X (abertura numérica, N.A. = 0,5). O PBS não ativa as células do cérebro. Se forem necessárias imagens do eixo Z, a lente objetiva é montada com um motor de lente ativado por piezoelétrico. Uma cabeça confocal de disco giratório é usada para melhorar a resolução do tempo. Para imagens com pouca luz, uma câmera de dispositivo acoplado de carga multiplicadora de elétrons é montada no microscópio. A imagem da fluorescência de GCaMP6s (excitação/emissão: 488/509 nm) requer um laser de 488 nm para excitação com um divisor de feixe dicróico e um filtro de emissão (ex., 528 ± filtro passa-banda de 38 nm).

1. Coloque a câmara de imagem contendo o explante cerebral sob o microscópio.
2. Abaixe a lente objetiva até que ela toque o PBS. Sob iluminação de campo claro, posicione o cérebro e coloque-o em foco. Mude para luz fluorescente e ajuste o foco nas células marcadas com GCaMP6s.
   NOTA: O verde basal fluorescência dos GCaMP6s deve ser visível.
3. Inicie a aquisição a 250 ms/quadro com uma resolução de 512 × 512 pixels no modo refrigerado a água usando o software de aquisição apropriado (ex., μManager). Ajuste o tempo de exposição para obter valores de fluorescência dentro da faixa dinâmica da câmera do dispositivo de carga acoplada (CCD), mas não inferior a 1000 (unidades arbitrárias), com imagens de 16 bits (faixa dinâmica de 0 a 65.535).
   NOTE: Um baixo tempo de exposição deve ser usado para minimizar o fotobranqueamento dos GCaMP6s. O tempo de exposição deve ser otimizado em cada experimento, pois depende dos níveis de expressão de GCaMP6 e da sensibilidade do sistema de detecção. Foi de 100 ms em nosso experimento usando dilp2>GCaMP6s. Quando são necessárias secções em z para uma determinada profundidade de imagem, podem ser adquiridas várias imagens de secção em z dependendo do tempo de exposição e dos intervalos de fotogramas. Se a câmera tiver resolução espacial suficiente, o tamanho do binning (número de registros no chip que serão armazenados em um pixel digital) deve ser aumentado para reduzir o tempo de exposição.
4. Depois que os parâmetros de imagem forem determinados, tire imagens por 1 minuto antes da administração do peptídeo para detectar intensidades de sinal de linha de base (F₀).
5. Aplique o peptídeo de teste; para isso, dissolva 100 μL de solução peptídica em PBS e pipete-o diretamente no banho larval para obter uma concentração ideal.
   NOTA:<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> O peptídeo a solução deve ser injetada lentamente (e.g., vazão de 20 μL / s) na solução do banho usando uma pipeta. Um peptídeo sintético não relacionado dissolvido em PBS é usado como controle negativo.
6. Registre a emissão de GCaMP6s por alguns minutos.

Resultados

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Haste de tungstênio	A-M systems, Sequim, WA	717000
Blu Tack	Bostik, Paris, França	3049100	Adesivos reutilizáveis semelhantes a massa<
Vidro do relógio, quadrado, 1 5/8 pol	Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, EUA	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japão	T900	Sais tamponados fosfatados
CCHa2	SCRUM Inc., Tóquio, Japão<	Peptídeo sintetizado por Custum
Ghrerin	Peptide institute Inc., Osaka, Japão	4372-s
Nociceptin	Peptide institute Inc., Osaka, Japão	4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha	Axio Imager A2	Microscópio de fluorescência
Objetivo W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha	420957-9900-000	Lente objetiva de imersão em água
P-725 PIFOC scanner de objetiva com longo alcance de deslocamento	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Alemanha	N/A	Movimento de lente ativado piezoelétrico
Unidade de scanner confocal CSU-W1	Yokogawa Electric Corporation, Tóquio, Japão style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Arial;font-size:10pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;text-align:center;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>CSU-W1	Cabeça confocal do disco giratório
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japão	C9100-13	Câmera EM-CCD
OBIS 488 nm LS 60 mW	Coerente, Santa Clara, CA, EUA	1178770	488-nm laser
488/568/647 nm Yokogawa dicroico beamsplitter	Semrock, Rochester, NY, EUA	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	Divisor de feixe dicróico
528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter	Semrock, Rochester, NY, EUA	FF01-528/38-25<
μManager	Open Imaging, Inc.	N/A	https://micro-manager.org

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