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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.1. Extração de cérebro, seccionamento e preparação de tecidos
- Sacrifica a cepa de mouse de tipo selvagem C57BL/6 sacrificando profundamente com CO2 asfixia por 5 min. Assegure a morte por luxação cervical.
- Limpe a cabeça do mouse com etanol 70%.
- Realize a craniectomia usando tesouras e pinças estéreis, puxando primeiro a pele, começando pelo topo da cabeça para expor o crânio.
- Então, quando o crânio estiver exposto, remova o crânio descascando o osso peça por peça, começando pelo lado posterior e movendo-se em direção ao lado anterior. Tenha cuidado para não destruir os ventrículos cerebrais.
- Reúna todo o cérebro.
- Coloque o cérebro em uma placa de Petri de 100 mm contendo o meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)/alta glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e solução de penicilina/estreptomicina a 1% contendo 10.000 unidades/ml de penicilina e 10.000 μg/ml de estreptomicina e pré-aquecido a 37 °C.
- Corte o cérebro no plano sagital mediano com a mão com uma lâmina afiada e use um vibratomo para obter a primeira seção de 100-200 mm de cada metade.
- Enxágue o tecido cerebral com solução salina tamponada com fosfato a 37 °C pré-aquecida (1x PBS).
- Coloque imediatamente a seção cerebral em meio DMEM / alto teor de glicose pré-aquecido a 37 ° C.
2. Configuração e configuração de imagens ao vivo
- Colocar as secções de tecido cerebral em placas de cultura com fundo de vidro de 30 mm contendo 1 ml de meio DMEM/Elevado teor de glicose. Ajuste o ambiente da câmara fechada do microscópio para 37 °C, 95%/5% O2/CO2 content (Figura 1).
- Usando uma lente objetiva de imersão em óleo de 60X, colete as imagens das células ependimárias/cílios colocando uma gota de óleo na lente objetiva de 60X e focando nas células com luz transmitida por contraste de interferência diferencial regular (DIC).
- Em seguida, siga a direção do movimento da bolha DMEM como um guia para a localização dos cílios ependimários móveis, pois os batimentos ciliares criam uma espécie de movimento de bolha na área. Escolha uma área contendo células saudáveis com cílios móveis no ventrículo lateral do cérebro usando o filtro DIC. Uma vez encontrados os cílios ependimários, ajuste a luz e o foco para obter uma imagem satisfatória.
- Usando o software de imagem Metamorph, defina os parâmetros de imagem ao vivo de acordo com uma finalidade específica. Na presente demonstração, adquira imagens de vinte e quatro bits com o binning da câmera definido como 1 x 1 combinado com uma objetiva de 60X e um tempo de exposição de 5 a 10 ms.
- Colete as imagens DIC abrindo a abertura do microscópio para um nível ideal por um tempo mínimo de exposição. Observe as imagens ao vivo transmitidas para a câmera para fornecer aquisição de imagem rápida e imediata sem demora. Calcule a velocidade de batimento dos cílios com base na exigência de tempos mínimos de exposição para obter contraste de imagem suficiente.
