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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Revisão Ética Animal.
1. Preparação de Tecido Cerebral e Imagem SBFSEM
- Anestesiar um camundongo preto C57 jovem (~2 - 4 meses de idade) (cepa C57BL/6J) usando 4 - 5% de isoflurano seguindo as diretrizes institucionais. Confirme a anestesia monitorando a perda de tônus muscular, a falta de movimentos voluntários e as respostas a estímulos aversivos, como um beliscão na cauda.
- Prenda o mouse em uma bandeja de dissecção e faça uma incisão na pele ao longo da linha média ventral. Faça mais incisões na pele para expor a caixa torácica do camundongo. Incisar o diafragma, dissecar cuidadosamente a cavidade torácica ao longo da periferia para expor o coração batendo e, em seguida, fazer uma incisão no átrio direito.
- Usando uma cânula borboleta, canule o ventrículo esquerdo. Perfundir o camundongo por via transcardíaca usando 10 a 20 ml de solução salina tampão fosfato (PBS) pH 7,2, até que a exsanguinação seja confirmada por uma mudança na cor do fígado.
Nota: Uma mudança na cor do fígado é usada como guia para determinar a extensão da exsanguinação. Confirme se a cor do fígado muda de marrom avermelhado para rosa pálido. - Perfundir o camundongo por via transcardíaca usando 10 a 20 ml de glutaraldeído a 2% e paraformaldeído a 4% feitos em tampão cacodilato 0,10 M (pH 7,2), para fixar o tecido cerebral rapidamente por dentro. A fixação é monitorada observando o enrijecimento da cauda.
Nota: Preparar tampão cacodilato 0,10 M (pH 7,2) dissolvendo 2,14 g de cacodilato de sódio em 80 ml de água, adicionar ácido clorídrico para ajustar o pH e completar o volume para 100 ml com água. - Após a perfusão, decapite o camundongo dissecar o cérebro, seguido de fixação em tampão de cacodilato de sódio 0,10 M (pH 7,2) contendo 2% de glutaraldeído e 4% de paraformaldeído por 48 horas a 4 oC.
- Após 48 horas, faça cortes coronais de 400 μm usando um vibratomo e, em seguida, disseque cuidadosamente a região de interesse no cérebro (por exemplo, o hipocampo) sob o microscópio de dissecação. Apare cuidadosamente o tecido e tire uma foto para preservar a orientação.
Nota: Os métodos de pós-processamento de coloração de tecidos no SBFSEM combinam uma variedade de métodos de coloração de metais pesados para melhorar a resolução. . - Lave os tecidos fixados com glutaraldeído 3 vezes, 5 min cada, em tampão cacodilato 0,1 M (pH 7,2).
- Prepare a solução de ácido tânico a 0,1% dissolvendo o ácido tânico em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,2). Agitar até dissolver e filtrar através de um filtro de 0,45 μm, se necessário.
- Fixe os tecidos com ácido tânico a 0,1% tamponado com cacodilato, incubando em 1 ml de reagente por 30 a 60 min em RT.
Nota: O tempo de incubação depende do tamanho do tecido, mas 30 min funciona melhor para a maioria dos tecidos. - Lave os tecidos 3 vezes, 5 min cada, em tampão cacodilato (pH 7,2).
- Dissolver 0,3 g de ferrocianeto de potássio e 0,86 g de cacodilato de sódio em 10 ml de H2O (dH2O). Mantenha a solução de ferrocianeto de potássio no gelo. Pouco antes de usar, adicione 10 ml de tetróxido de ósmio a 4% (OsO4).
- Manchar os tecidos com solução de ferrocianeto de ósmio a 2% por 90 min, em gelo. Lave 3 vezes, 5 min cada em dH2O.
- Prepare a solução de tiocarbohidrazida (TCH) a 1% dissolvendo 0,1 g de TCH em 10 ml dH2O. Dissolver a 60 °C agitando de 10 em 10 minutos até dissolver totalmente. Observe as precauções de segurança ao manusear o TCH, principalmente tomando cuidado para evitar o uso de metais, aquecimento a altas temperaturas ou permitir que a solução seque.
- Trate as amostras com TCH a 1% recém-preparado por 20 min em RT. Lave 3 vezes, 5 min cada, em dH2O.
- Diluir 4% OsO4 a 2% com dH2O, e corar os tecidos com 2% de tetróxido de ósmio aquoso incubando por 1 hora. tecidos 3 vezes, 5 min cada, com dH2O.
- Incube as amostras O/N em acetato de uranila a 1% em dH2O a 4 °C.
- Prepare a solução de aspartato de chumbo de Walton.
- Dissolva 0,998 g de L-Aspartato em 250 ml dH2O e, em seguida, adicione 10 N de hidróxido de potássio (KOH) gota a gota até que o pH atinja 5,5. Após o ajuste do pH, adicione 0,066 g de nitrato de chumbo em 10 ml de ácido aspártico e aqueça a 60 °C por 30 min.
- Enxágue os lenços de papel em dH2O e incubar com a coloração de aspartato de chumbo de Walton por 30 min em um forno a 60 ° C. Lave 3 vezes, 5 min cada, em dH2O.
- Desidratar amostras através de uma série graduada de álcool usando soluções resfriadas de etanol a 20%, 50%, 75%, 85% e 95% por 5 min cada, seguidas de etanol a 100% 3 vezes, 10 min cada.
Nota: Use 100% de etanol de garrafas recém-abertas, pois o etanol aberto absorve água do ar e faz com que a incorporação falhe. Incubações mais longas serão necessárias com amostras de tecido maiores. - Lave as amostras 2 vezes, 15 min cada, em óxido de propileno.
- Faça resina de incorporação de plástico usando 25 ml de resina, 10,5 ml de DDSA (anidrido dodecenil succínico), 15,5 ml de NMA (anidrido de metila nadic) e 1 ml de DMP-30 (2,4,6-Tris dimetilaminometil fenol). Misture a resina agitando. Gire e deixe a resina repousar até que as bolhas desapareçam.
Nota: Esta é a receita padrão de dureza média. Outros tipos de resina plástica de microscopia eletrônica (EM) podem ser usados, mas devem ser testados com uma amostra de controle não essencial com antecedência, pois nem todas as resinas funcionam para o SBFSEM. - Incubar os tecidos O/N em uma mistura 50:50 de resina de incorporação e óxido de propileno em um frasco que é tampado inicialmente e destampado após 2 horas, de modo que o óxido de propileno evapore por um período de cerca de 8 a 10 horas.
- Transfira os tecidos para resina de incorporação 100% fresca em frascos limpos por 2 horas.
- Incorporar amostras em resina de incorporação fresca, em moldes planos contendo etiquetas de papel impressas, e curá-las em estufa a 60 °C durante 48 horas. Após cerca de 1 hora, verifique novamente a colocação e o alinhamento do tecido e ajuste, se necessário.
- Apare as amostras na área de interesse e monte-as em um pino de alumínio usando supercola de cianoacrilato gelificante ou uma resina epóxi condutora. Em seguida, cubra as laterais do bloco com pasta de prata coloidal para fornecer um caminho condutor para o pino de alumínio.
- Examine amostras de tecido usando um sistema de microscópio eletrônico de varredura equipado com um estágio de ultramicrótomo na câmara e detector de elétrons retroespalhados de baixo kV.
Nota: Obtenha treinamento em instrumentos e locais no uso de microscopia eletrônica de varredura (SEM) e torne-se um usuário autorizado. Alternativamente, a colaboração com um pesquisador ou instalação central para pequenos projetos pode ser possível. O treinamento de radiação também pode ser necessário, pois os SEMs geram raios-x. - Para obter imagens das amostras, use as seguintes configurações: 2,25 kV, com resolução de 5 a 10 nm/pixel, com tamanhos de campo entre 80 a 250 μm em x,y (outros tamanhos de campo possíveis) e espessura de fatia de 50 a 100 nm, com um total de 250 a 600 fatias em um período de 16 a 20 horas.
Nota: As configurações variam substancialmente entre diferentes microscópios, amostras individuais e resolução desejada. Essas configurações devem produzir imagens que sejam prontamente interpretáveis para muitas amostras.
2. Analisando o conjunto de dados de imagens
Nota: O software Image J/Fiji é usado para analisar o conjunto de dados e se baseia no plug-in TrakEM2. As etapas de pré-processamento podem ser executadas usando uma variedade de softwares e podem ser extensas ou menores, dependendo do nível de experiência e das pilhas obtidas. As principais transformações usando o software de código aberto (ImageJ ver 1.50b, download FIJI em 1º de outubro de 2015) são descritas aqui.
- Converta imagens para o formato tiff de 8 bits a partir das imagens proprietárias originais de 16 bits abrindo o software e selecionando os itens de menu Image→Type→8 bit.
- Se a conversão automática de contraste/brilho durante esta etapa não for ideal para imagens, reabra as imagens de 16 bits e pressione Image→Adjust→Brightness/Contrast. Selecione um intervalo que funcione para todas as imagens e pressione Aplicar. Em seguida, execute a conversão. Nota:<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> Em alguns SEMs, esta etapa pode exigir microscópio software do fabricante.
- Se necessário, devido ao movimento inaceitável da imagem entre fatias (e.g<span style='font-family:Arial,sans-serif; tamanho da fonte:12pt; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; peso da fonte: 400; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; espaço em branco: pré-encapsulamento;' >. desvio devido ao carregamento), registre/alinhe as pilhas de imagens (itens de menu Plugins→Registration→Linear StackAlignmentWithSIFT). Na maioria dos softwares de registro, defina para o modo "somente tradução" em vez de "corpo rígido".
Nota: Muitas abordagens e softwares podem funcionar: o plug-in de registro SIFT funciona para muitos aplicativos e há uma versão de pilha virtual.- Se necessário, aumente o tamanho da tela antes do registro (Image→Adjust→CanvasSize) ou reduza-o a uma área de interesse (Image→Crop).
Nota: Pode ocorrer algum desvio ou espalhamento, e tentar outros plug-ins ou softwares pode produzir melhores resultados. Opções manuais também estão disponíveis (e.g<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>. ImageJ/FIJI, Plugins→Registration→ManualLandmarkSelection).
- Se desejar, dimensione as imagens para um tamanho menor e mais gerenciável (ex. 25%) usando ImageJ (Image→Scale).